メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索
Summary
ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。
Abstract
肥満は、心血管疾患、2型糖尿病、および肝臓疾患を発症するリスクを高める世界的な公衆衛生上の主要な問題です。肥満は脂肪細胞肥大や肥大による脂肪組織(AT)質量の増加を特徴とし、その三次元構造の深い改造につながる。確かに、肥満の間に拡大するATの最大容量は肥満関連病理の開発にとって極めて重要である。このAT拡張は、過剰なエネルギー摂取量への適応を可能にし、筋肉や肝臓などの他の代謝器官への有害な脂質の波及を避けるために重要な恒食機構です。従って、AT拡張の失敗につながる構造改造を理解することは、臨床的適用性の高い根本的な問題である。本稿では、蛍光イメージングによるマウスとヒト白脂肪組織の形態を探求するために当研究室で日常的に使用されている、シンプルで高速なクリアリング方法について説明します。この最適化されたATクリアリング方法は、化学フード、温度制御軌道シェーカー、蛍光顕微鏡を備えた標準的な実験室で簡単に行われます。また、使用する化学化合物は容易に入手可能である。重要なことに、この方法は、様々なマーカーを染色することによって3D AT構造を解決し、アディポ細胞、神経および血管ネットワーク、および先天的および適応的な免疫細胞分布を特異的に視覚化することを可能にする。
Introduction
肥満は脂肪組織量の増加を特徴とし、肥満の人々が心血管疾患、2型糖尿病、肝臓病およびいくつかの癌を発症するリスクを高めていることを考えると、世界的に主要な公衆衛生問題となっている。
脂肪組織の基本的な生理学的機能は、全身グルコースおよび脂質恒常性11,22を調節することである。この摂食期間中、脂肪細胞(すなわち脂肪組織の主細胞)は、食事によって提供される過剰のグルコースおよび脂質をトリグリセリドに保存する。断食の間、脂肪細胞はトリグリセリドを非エステル化脂肪酸とグリセロールに分解して体のエネルギー需要を維持します。肥満の発症の間、脂肪組織は脂肪細胞のサイズ(肥大症)および/または数(過形成)を増加させることによって拡大し、その貯蔵能力を高める。脂肪組織の拡張がその限界に達すると、患者の間で一定の高い可変性、残りの脂質は筋肉および肝臓3、44を3含む他の代謝器官に蓄積し、その機能障害および肥満関連の心代謝合併症を発症する1,1、5。したがって、脂肪組織の拡張を支配するメカニズムを特定することは、臨床的な課題です。
肥満の間に脂肪組織内で文書化された形態学的修飾は、その病理学的機能不全に関連している。いくつかの染色手順は、アクチン6、血管マーカー7、脂質滴マーカー8、および特異的免疫細胞マーカー9、1010を含む脂肪組織の組織組織を記述するために使用されてきた。9しかし、アディポサイトの直径が大きい(50~200μm)11の11場合、肥満時に観測された劇的な構造AT変化を正確に分析するためには、組織全体の大部分を3次元で分析することが不可欠です。しかし、光が不透明な組織に浸透しないため、蛍光顕微鏡を用いた大組織試料内での3Dでのイメージングは不可能である。透明にする組織のクリアの方法は、文献で報告されています (レビューのために、12を参照してください ) 1 つの組織をクリアし、組織全体の顕微鏡を実施することができます。これらの方法は、健康で病気の組織における3D細胞組織を評価する前例のない機会を提供します。記載された各方法には利点と欠点があり、したがって、研究された組織に応じて慎重に選択する必要があります(レビューのために、13を参照)。実際、いくつかのアプローチは、高価な、有毒であるか、,,,または14、15、16、17、18、19を得14,15,ることが困難である材料または化合物の使用を長い潜伏期間および/または使用する必要があります。16171819ヴェルナー・スポルテホルツが1世紀前に使用した最初の化合物の1つを利用して組織20をクリアし、化学フード、温度制御軌道シェーカー、共焦点顕微鏡を含む標準的な機器を備えた実験室ですべてのマウスおよびヒト脂肪組織貯蔵庫のクリアに非常によく適応したユーザーフレンドリーで安価なプロトコルを設定しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
肥満などの病理学的進行の過程で脂肪組織内で起こる修飾は、病理学の背後にあるメカニズムの理解の基本である。脂肪組織におけるこのようなメカニズムを明らかにした先駆的な研究は、全体の脂肪組織プロテオミクス21、フローサイトメトリー22、23、および転写23体2224、25などの世界的なアプローチに24,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、INSERMによってサポートされました。 コート・ダジュール大学、そして将来のラベックス・シグナライフへの投資を通じたフランス国立研究庁(ANR)からの助成金(ANR-11-LABX-0028-01)、プログラムUCA JEDI(ANR-15-IDEX-01)、アカデミー2「システムズコンプレックス」とアカデミー4「コンプレックス・エ・ダイバート」を通じて フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(エキペFRM DEQ20180839587)とJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-ギレロン)に若い調査官プログラムを注ぎます。また、コンセシル・デ・アルプ・マリティームとレジオンPACAが出資するC3Mのイメージングコア施設に感謝し、IBISA顕微鏡・イメージングプラットフォームコートダジュール(MICA)も支援しています。マリオン・デュソットの組織準備に関する技術的な助けに感謝します。私たちは、原稿の証拠読み取りのためにアビー・カットトリス、UCA国際科学可視性に感謝します。
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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