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Genetics

उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण का उपयोग कर CALR जीन में आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस (एचआरएम) जेनेटिक वैरिएंट डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और रैपिड सॉल्यूशन है । यह अनुक्रम मतभेदों पर निर्भर करता है जिसके परिणामस्वरूप हेट्रोडुलेक्स पिघलने वाले वक्र के आकार को बदलते हैं। एचआरएम और एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को जोड़कर, विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट जैसे इनडेल्स की पहचान की जा सकती है।

Abstract

हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस (एचआरएम) जेनोटीपिंग और जेनेटिक वेरिएशन स्कैनिंग के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। अधिकांश एचआरएम अनुप्रयोग डीएनए रंगों को संतृप्त करने पर निर्भर करते हैं जो अनुक्रम मतभेदों का पता लगाते हैं, और हेट्रोडुपेक्स जो पिघलने वाले वक्र के आकार को बदलते हैं। एक संस्करण या जीनोटाइप की पहचान करने वाले छोटे पिघलने वक्र मतभेदों की पहचान करने के लिए उत्कृष्ट साधन संकल्प और विशेष डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट के साथ विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट जीन में एक विशिष्ट रोग के रोगियों के लिए विशिष्ट रूप से देखे जा सकते हैं, विशेष रूप से कैंसर और कैल्र जीन में फिलाडेल्फिया गुणसूत्र-नकारात्मक myeloproliferative neoplasms के साथ रोगियों में । एचआरएम विश्लेषण द्वारा ब्याज के जीन में एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन, सम्मिलन और/या विलोपन (इनडेल) का पता लगाया जा सकता है । विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान ज्यादातर क्यूपीसीआर एचआरएम परख में इस्तेमाल होने वाले नियंत्रणों पर आधारित होती है । हालांकि, जैसे-जैसे उत्पाद की लंबाई बढ़ती है, जंगली-प्रकार और हेट्रोज़िगोट घटता के बीच का अंतर छोटा हो जाता है, और आनुवंशिक संस्करण के प्रकार को निर्धारित करना अधिक कठिन होता है। इसलिए, जहां इनडेल्स ब्याज के जीन में अपेक्षित प्रचलित आनुवंशिक संस्करण हैं, एचआरएम परिणाम के स्पष्टीकरण के लिए एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस जैसे अतिरिक्त विधि का उपयोग किया जा सकता है। कुछ उदाहरणों में, मानक सेंगर अनुक्रमण द्वारा एक अनिर्णानीय परिणाम की पुन जांच/पुन निदान किया जाना चाहिए । इस पूर्वव्यापी अध्ययन में, हमने एमपीएन के साथ JAK2 V617F-नकारात्मक रोगियों के लिए विधि लागू की।

Introduction

कैल्मैटिकुलिन जीन(सीएएलआर)में दैहिक आनुवंशिक वेरिएंट को 2013 में माइलोप्रोप्रोलिफेरेटिव नियोप्लाज्म्स (एमपीएन) जैसे आवश्यक थ्रोम्बोसाइथेमिया और प्राथमिक मायलोफाइब्रोसिस1,2के रोगियों में मान्यता दी गई थी। तब से, CALR जीन में 50 से अधिक आनुवंशिक वेरिएंट की खोज की गई है, जो +1 (−1+2) फ्रेमशिफ्ट 3 को प्रेरित करतेहैं। दो सबसे अधिक बार CALR आनुवंशिक वेरिएंट एक ५२ बीपी विलोपन (NM_004343.३(CALR):c.1099_1150del52, पी (Leu367Thrfs * ४६)), भी टाइप 1 उत्परिवर्तन कहा जाता है, और एक 5 बीपी प्रविष्टि (NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, पी (Lys385Asnfs * 47)), भी प्रकार 2 उत्परिवर्तन कहा जाता है । ये दोनों जेनेटिक वेरिएंट सभी सीएएलआर जेनेटिक वेरिएंट का 80% प्रतिनिधित्व करते हैं। अन्य लोगों को टाइप 1-लाइक या टाइप 2 के रूप में वर्गीकृत किया गया है- जैसे जंगली प्रकार CALR4के करीब एक α हेलिक्स के संरक्षण के आधार पर एल्गोरिदम का उपयोग करना। यहां, हम सीएएलआर जेनेटिक वैरिएंट डिटेक्शन, हाई रेजोल्यूशन मेल्टिंग एनालिसिस मेथड (एचआरएम) के लिए बेहद संवेदनशील और रैपिड तरीकों में से एक पेश करते हैं । यह विधि टाइप 1 और टाइप 2 जेनेटिक वेरिएंट का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाती है, जो सीएएलआर म्यूटेशन 5 केबहुमतका प्रतिनिधित्व करती है। एचआरएम को 1997 में फैक्टर वी लीडेन6में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में वास्तविक समय »पॉलीमरेज चेन रिएक्शन«(क्यूपीसीआर) के संयोजन में पेश किया गया था। गोल्डन स्टैंडर्ड तकनीक का प्रतिनिधित्व करने वाले सेंगर सीक्वेंसिंग की तुलना में, एचआरएम एक अधिक संवेदनशील और कम विशिष्ट विधि5है। एचआरएम विधि एक अच्छी स्क्रीनिंग विधि है जो बड़ी संख्या में नमूनों का तेजी से विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है, जिसमें बड़ी लागत-लाभ5होता है। यह फ्लोरोसेंट डाई की उपस्थिति में किया जाने वाला एक सरल पीसीआर विधि है और विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं होती है। एक अन्य लाभ यह है कि प्रक्रिया स्वयं विश्लेषण किए गए नमूने को नुकसान या नष्ट नहीं करती है जो हमें एचआरएम प्रक्रिया7के बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस या सेंगर अनुक्रमण के लिए नमूने का पुन: उपयोग करने की अनुमति देता है । एकमात्र नुकसान यह है कि कभी-कभी परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल होता है। इसके अतिरिक्त, एचआरएम गैर-प्रकार 1 या टाइप 2 म्यूटेशन8के साथ रोगियों में सटीक उत्परिवर्तन का पता नहीं लगाता है। इन रोगियों में, सेंगर अनुक्रमण किया जाना चाहिए(चित्र 1)।

एचआरएम डीएनए फ्लोरोसेंट डाई को संतृप्त करने की उपस्थिति में विशिष्ट डीएनए क्षेत्र के प्रवर्धन पर आधारित है, जिसे डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) में शामिल किया गया है। फ्लोरोसेंट डाई डीएसडीएनए में शामिल होने पर प्रकाश उत्सर्जित करता है। तापमान में एक प्रगतिशील वृद्धि के बाद, DsDNA एकल फंसे डीएनए में टूट जाता है, जो फ्लोरेसेंस तीव्रता में अचानक कमी के रूप में पिघलने वक्र पर पता लगाया जा सकता है । पिघलने वाले वक्र का आकार डीएनए अनुक्रम पर निर्भर करता है जिसका उपयोग उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जाता है। नमूनों के पिघलने घटता ज्ञात उत्परिवर्तन या जंगली प्रकार CALR के पिघलने घटता की तुलना में कर रहे हैं । अलग - अलग पिघलने वाले मोड़ एक अलग उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं जो गैर टाइप 1 या टाइप 29है ।

एचआरएम द्वारा कैलआर जीन में दैहिक आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने के लिए एल्गोरिदम, एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और अनुक्रमण विधि(चित्रा 1)का उपयोग10से पहले प्रकाशित पूर्वव्यापी अध्ययन में किया गया था और मान्य किया गया था।

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Protocol

इस अध्ययन को स्लोवेनिया गणराज्य की मेडिकल एथिक्स की समिति ने मंजूरी दी थी । सभी प्रक्रियाएं हेलसिंकी घोषणा के अनुसार थीं ।

1. फ्लोरेसेंस आधारित मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) और एचआरएम द्वारा क्यूपीसीआर विश्लेषण के बाद

  1. रिसुस्पेंड प्राइमर को सामग्री की तालिका में बाँझ, RNase और DNase मुक्त एच 2 ओ (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ100माइक्रोनएम के लिए सूचीबद्ध किया गया है। एक 10 μM काम एकाग्रता प्राइमर बनाओ। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर2से पहले प्रकाशित किए गए थे ।
  2. निर्माता के निर्देश11 (सामग्रीकी तालिका देखें) के बाद फ्लोरेसेंस स्टेनिंग विधि द्वारा क्वांटिटेट ग्रैनुलोसाइट्स डीएनए। 10 एमएम ट्रिस-सीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 9.0 (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 20 एनजी/μL डीएनए समाधान तैयार करें।
    1. डीएनए नमूनों के अलावा, कम से कम तीन डीएनए नियंत्रण तैयार करें: NM_004343.3(सीएएलआर)के साथ दो सकारात्मक नियंत्रण: c.1099_1150del52, पी (Leu367Thrfs * 46) (52 बीपी विलोपन या टाइप 1 उत्परिवर्तन), और NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, पी (Lys385Asnfs * 47) (5 बीपी प्रविष्टि या प्रकार 2 उत्परिवर्तन) आनुवंशिक संस्करण, साथ ही जंगली प्रकार डीएनए और नकारात्मक नियंत्रण एक गैर टेम्पलेट (एनटीसी) नियंत्रण के रूप में ।
      नोट: एचआरएम सेटअप करने से पहले, पुष्टि करें कि क्यूपीसीआर उपकरण एचआरएम प्रयोगों के लिए कैलिब्रेट है।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार क्यूपीसीआर एचआरएम मास्टर मिक्स तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) इस प्रकार: डाई के साथ 2x क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन, 0.2 माइक्रोनल ऑफ 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर, 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर के 0.2 माइक्रोन, बाँझ, RNase और DNase मुक्त एच 2 O के8.6माइक्रोन सामग्री की तालिकासे प्राइमर का उपयोग करें। प्रत्येक डीएनए नमूने और नियंत्रण के लिए तीन प्रतिकृति चलाएं।
    1. कार्रवाई किए जा रहे नमूनों की संख्या के अनुसार क्यूपीसीआर एचआरएम मास्टर मिक्स तैयार करें। रिएजेंट ट्रांसफर के दौरान होने वाले नुकसान के लिए अतिरिक्त मात्रा प्रदान करने के लिए गणना में कम से कम 10% की अतिरिक्त मात्रा शामिल करें।
  4. धीरे-धीरे टैप करके और ट्यूब को उलटा करके प्रतिक्रिया सामग्री मिलाएं और 2-3 एस के लिए भंवर करें। ट्यूब की दीवार से नीचे तक एक संक्षिप्त स्पिन द्वारा सभी बिखरी हुई बूंदों को इकट्ठा करें।
  5. उपकरण और एचआरएम प्रयोग के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया प्लेट तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)। क्यूपीसीआर एचआरएम मास्टर मिक्स के 19 माइक्रोन को 96-वेल ऑप्टिकल रिएक्शन प्लेट के उपयुक्त कुओं में स्थानांतरित करें।
  6. ऑप्टिकल प्रतिक्रिया प्लेट के उपयुक्त कुओं में नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण और नमूनों का 1 माइक्रोल। एनटीसी के लिए डीएनए के बजाय क्यूपीसीआर एचआरएम मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले बाँझ, आरएनएसई और डीएनएस फ्री एच 2 ओ के1माइक्रोन ट्रांसफर करें ।
  7. ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ रिएक्शन प्लेट को सील करें। रन के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए इसे मजबूती से करें। जांच करें कि ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म सही फ्लोरेसेंस डिटेक्शन सुनिश्चित करने के लिए प्रतिक्रिया प्लेट में सभी कुओं में विमान है।
  8. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 780 x ग्राम पर प्रतिक्रिया प्लेट स्पिन करें। जांच करें कि तरल प्रतिक्रिया प्लेट में कुओं के नीचे है या नहीं। परख चलाने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । 24 घंटे से अधिक नहीं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेट को आरटी को गर्म करने की अनुमति दें, और फिर इसे चलाने से पहले प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें।
  9. निर्माता के निर्देश के अनुसार तैयार है और चलाने के लिए बढ़ाना और डीएनए पिघला और qPCR साधन में एचआरएम फ्लोरेसेंस डेटा उत्पन्न करने के लिए शुरू करते हैं । साधन प्रणाली सॉफ्टवेयर में, उचित कुओं को नियंत्रण और नमूने आवंटित करें।
  10. CALR आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने के लिए, डिफ़ॉल्ट साधन प्रवर्धन प्रोटोकॉल बदलें और निम्नलिखित थर्मल साइकिलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए को बढ़ाना: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 50 चक्र और 60 एस के लिए 62.5 डिग्री सेल्सियस।
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूपीसीआर के तुरंत बाद पिघल वक्र/वियोजन (एचआरएम) चरण का प्रदर्शन करें 12 इस प्रकार हैं:10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और फिर 95 डिग्री सेल्सियस तक 0.025 डिग्री सेल्सियस/s की रैंप दर। तापमान को 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  12. रन अपने आप समाप्त हो जाता है। सबसे पहले, प्रवर्धन प्लॉट(चित्रा 2)की समीक्षा और सत्यापन करें।
  13. इंस्ट्रूमेंट सिस्टम सॉफ्टवेयर के प्रयोग मेनू में, प्रवर्धन प्लॉट विकल्प का चयन करें। यदि कोई डेटा प्रदर्शित नहीं होता है, तो हरे बटन का विश्लेषणकरने पर क्लिक करें।
    1. प्रवर्धन प्लॉट टैब में, प्लॉट टाइप ड्रॉप-डाउन मेनू से, उस भूखंड का चयन करें जो प्रवर्धन डेटा को प्रदर्शित करता है क्योंकि कच्चे फ्लोरेसेंस रीडिंग को चक्र संख्या (एनएआरएन बनाम साइकिल) के एक समारोह के रूप में निष्क्रिय संदर्भ (एनएएनएन) से फ्लोरेसेंस में सामान्यीकृत किया जाता है। प्लॉट कलर ड्रॉप-डाउन मेन्यू में, नमूनाचुनें।
  14. ग्राफ प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू से, रैखिक प्रवर्धन ग्राफ प्रकार का चयन करें। बेसलाइन स्टार्ट विकल्प का चयन करके रैखिक प्रवर्धन ग्राफ पर बेसलाइन स्टार्ट और एंड साइकिल दिखाएं। सत्यापित करें कि बेसलाइन सही ढंग से सेट है। अंत चक्र चक्र संख्या जहां महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट संकेत का पता चला है पहले कुछ चक्र निर्धारित किया जाना चाहिए। बेसलाइन आमतौर पर 3 से 15 चक्र(चित्रा 2)से सेट किया जाता है।
  15. ग्राफ प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू से, log10 प्रवर्धन ग्राफ प्रकार का चयन करें। थ्रेसहोल्ड विकल्प चुनकर ग्राफ पर थ्रेसहोल्ड लाइन दिखाएं. सीमा को तदनुसार समायोजित करें यदि सही ढंग से सेट नहीं किया गया है। सही ढंग से निर्धारित सीमा का मतलब है कि दहलीज लाइन क्यूपीसीआर घटता(चित्रा 2)के घातीय चरण को पार करती है ।
  16. सत्यापित करें कि सामान्य प्रवर्धन घटता सभी नमूना और सकारात्मक नियंत्रण कुओं में हैं। सत्यापित करें कि चक्र 40 से पहले एनटीसी कुओं में कोई प्रवर्धन नहीं है। एक सामान्य प्रवर्धन भूखंड फ्लोरेसेंस में घातीय वृद्धि दिखाता है जो चक्र 15 और 35(चित्र 2) केबीच की सीमा से अधिक है। यदि अच्छी स्थिति में कोई प्रवर्धन नहीं है तो नमूना कुओं को विश्लेषण से बाहर करें।
    नोट: यदि प्रवर्धन साजिश असामान्य दिखती है या एनटीसी अच्छी तरह से प्रवर्धन को इंगित करता है, तो निर्माता के समस्या निवारण गाइड के अनुसार समस्या की पहचान और समाधान करें।
  17. क्वांटिफिकेशन चक्र (सीक्यू) मूल्य के साथ आउटलियर को बाहर करें जो इंस्ट्रूमेंट सिस्टम सॉफ्टवेयर12में 2 से अधिक की प्रतिकृति से अलग है। आउटलर्स गलत एचआरएम परिणाम पैदा कर सकते हैं।
  18. डेरिवेटिव मेल्ट वक्र्स में, पूर्व और पिघलने के बाद के क्षेत्रों/तापमान रेखाओं की समीक्षा करें । पूर्व और बाद के पिघल क्षेत्र एक सपाट क्षेत्र के भीतर होने चाहिए जहां फ्लोरोसेंट स्तर(चित्रा 3)में कोई बड़ी चोटियां या ढलान नहीं हैं। यदि जरूरत हो तो इसे तदनुसार समायोजित करें। एक दूसरे से लगभग 0.5 डिग्री सेल्सियस के अलावा प्री-और पोस्ट-पिघल तापमान लाइनों के स्टार्ट और स्टॉप सेट करें(चित्र 3)। विश्लेषण को फिर से शुरू करें यदि पैरामीटर विश्लेषण बटन पर क्लिक करके समायोजित किए जाते हैं।
  19. अंतर प्लॉट टैब में, प्लॉट सेटिंग्स टैब में, वाइल्ड-टाइप कंट्रोल (होमोज़िगोट) में से एक को संदर्भ डीएनए के रूप में दोहराता है और विश्लेषण बटन पर क्लिक करके विश्लेषण को पुनः आरंभ करता है।
  20. गठबंधन पिघल घटता टैब में, पुष्टि करें कि सभी सकारात्मक नियंत्रणों में सही जीनोटाइप होता है और एनटीसी(चित्र 4)को बढ़ाना विफल रहा है। अच्छी तरह से मेज से, विश्लेषण भूखंडों में इसी पिघल वक्र को उजागर करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण युक्त कुओं का चयन करें । पुष्टि करें कि रेखा का रंग सही जीनोटाइप से मेल खाता है। अन्य सकारात्मक नियंत्रण और एनटीसी युक्त कुओं के लिए कदम दोहराएं।
  21. गठबंधन पिघल घटता टैब में, ध्यान से अज्ञात नमूनों के लिए साजिश प्रदर्शित करता है की समीक्षा करें और नियंत्रण के लिए साजिश प्रदर्शित करताहै (चित्रा 4)के लिए उनकी तुलना करें । अच्छी मेज से, अज्ञात नमूना प्रतिकृति युक्त कुओं का चयन करें, पिघल वक्र के रंग की जांच करें और एक के बाद एक सकारात्मक नियंत्रण वाले कुओं का चयन करके उन्हें एक आदेशित अनुक्रम में नियंत्रण के साथ संरेखित करें। सभी अज्ञात नमूनों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: अज्ञात नमूने में नियंत्रण में से एक का संस्करण होता है यदि इसका पिघलने वाला वक्र इसके साथ कसकर गठबंधन किया जाता है। विभिन्न वैरिएंट समूहों (विभिन्न रंगों) को प्रदर्शित किया जा सकता है जो यह दर्शाता है कि अज्ञात नमूने में एक अज्ञात संस्करण होता है, जो नियंत्रण(चित्र 8)के अनुरूप नहीं होता है। दैहिक आनुवंशिक संस्करण का एक निम्न स्तर रोगी के नमूने में मौजूद हो सकता है। यह एचआरएम परिणाम की व्याख्या को प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से परख की पहचान सीमा पर(चित्रा 9)। इन मामलों में, रंग या यहां तक कि रेखा का आकार भी जंगली प्रकार के जीनोटाइप के समान हो सकता है।
    1. जब परिणाम बेनतीजा रहे, तो एचआरएम परिणामों को एगरॉंग्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और अनुक्रमण विधियों के परिणामों के साथ मिलाएं। नमूने या अनुरोध को फिर से जांचें और यदि आवश्यक हो तो एक नए नमूने का पुनर्परीक्षण करें।
    2. ध्यान से दोहराने घटता के लिए सेट डेटा की समीक्षा करें और जांच करें कि समूह के भीतर प्रत्येक दोहराने का संरेखण तंग है। यदि यह समूह (आउटलियर) में अन्य नमूनों के साथ कसकर संरेखित नहीं करता है तो दोहराने को बाहर करें। यदि अधिक बाहरी व्यक्ति मौजूद हैं और परिणाम अनिर्णाित हैं तो नमूने को फिर से परीक्षण करें। ध्यान रखें कि डीएनए नमूने की मात्रा और गुणवत्ता एचआरएम परिणामों को प्रभावित करते हैं।
  22. अंतर प्लॉट टैब में अज्ञात नमूने के लिए परिणाम का विश्लेषण करें। चरण 1.21 में वर्णित प्रक्रिया को दोहराएं और सत्यापित करें कि अज्ञात नमूने के लिए प्राप्त परिणाम समान हैं।
  23. इसके बाद एग्रिस जेल पर क्यूपीसीआर एचआरएम प्रोडक्ट्स चलाएं।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । प्लेट को 24 घंटे से अधिक या लंबी अवधि के समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें लेकिन 7 दिनों से अधिक नहीं। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेट को आरटी को गर्म करने की अनुमति दें, और फिर इसे चलाने से पहले प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें। प्लेट को गल जाने और आरटी के लिए गर्म करने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की अनुमति दें, और फिर इसे चलाने से पहले प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें।

2. एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. 4% एग्रिजेड प्री-कास्ट जेल पर क्यूपीसीआर एचआरएम उत्पादों को चलाएं जिसमें उपयुक्त जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम का उपयोग करके फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग होता है (सामग्री की तालिकादेखें, चित्रा 5)। केवल एक सकारात्मक, नकारात्मक, एनटीसी और नमूना qPCR एचआरएम दोहराने चलाएं।
    नोट: दस्ताने हमेशा जब जैल हैंडलिंग पहना जाना चाहिए । यदि समकक्ष एगर उठे प्रतिशत, फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग और अच्छी तरह से प्रारूप को चुना जाता है तो कोई भी अन्य जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम इस उद्देश्य को पूरा कर सकता है।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम चलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। पैकेज से कैसेट में प्री-कास्ट जेल निकालें, कंघी को हटा दें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार इसे उपकरण में डालें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: पैकेज खोलने के 15 मिनट के भीतर जेल लोड करें।
  3. बाँझ, RNase और DNase मुक्तएच2 O. पतला नमूना के 20 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से लोड के साथ 20 μL नमूना पतला।
  4. डीएनए आकार मानक समाधान के 3 माइक्रोन को बाँझ, RNase और DNase मुक्त एच 2 ओ (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ20माइक्रोन करने के लिए पतला करें। पतला डीएनए आकार मानक समाधान(चित्रा 6)के 20 माइक्रोन के साथ एम अच्छी तरह से लोड करें।
  5. बाँझ, RNase और DNase मुक्त एच 2 ओ के20μL के साथ किसी भी खाली कुओं भरें ।
  6. तुरंत जेल चलाने के प्रतिशत के अनुसार कार्यक्रम का चयन करें और 10 मिनट के लिए उपकरण पर रन समय निर्धारित करते हैं।
  7. गो बटन दबाकर लोडिंग सैंपल के 1 मिनट के भीतर इलेक्ट्रोफोरेसिस शुरू करें। यदि अपर्याप्त संकल्प प्राप्त किया जाता है तो इलेक्ट्रोफोरेसिस समय बढ़ाया जा सकता है।
    नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार अधिकतम अनुशंसित एगरल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस रनिंग टाइम से अधिक न करें।
  8. जब इलेक्ट्रोफोरेसिस पूरा हो जाता है, तो नीली रोशनी या यूवी ट्रांसिल्यूमिनेशन का उपयोग करके जेल में डीएनए की कल्पना करें। इलेक्ट्रोफोरेसिस छवियों की कल्पना, विश्लेषण और भंडारण ज्यादातर फोटो-प्रलेखन प्रणाली(चित्रा 5)के साथ एक जेल इमेजर द्वारा किया जाता है।
  9. अज्ञात नमूने के परिणामों की तुलना सकारात्मक नियंत्रण(चित्र 7 और चित्रा 8)से करके कल्पना क्यूपीसीआर एचआरएम उत्पादों जेल पैटर्न का विश्लेषण और व्याख्या करें।
  10. यदि अज्ञात नमूना एचआरएम और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणाम इंगित करता है कि एक अज्ञात आनुवंशिक संस्करण मौजूद है, तो13वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार सामग्री की तालिका में वर्णित प्राइमर का उपयोग करके क्यूपीसीआर एचआरएम उत्पाद को अनुक्रम करें।
    सावधानी: फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग युक्त एग्रसिंग जैल को प्रति संस्थान विनियमों का उचित निपटान किया जाना चाहिए।

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Representative Results

फ्लोरोसेंस में घातीय वृद्धि के साथ ब्याज का सफलतापूर्वक परिलक्षित डीएनए क्षेत्र जो चक्र 15 और 35 के बीच की सीमा से अधिक है और सभी दोहराए गए नमूनों और नियंत्रणों(चित्रा 2)में मात्राकरण (सीक्यू) के चक्र के बहुत संकीर्ण मूल्य एचआरएम विश्लेषण द्वारा आनुवंशिक वेरिएंट की विश्वसनीय पहचान के लिए एक शर्त है। यह फ्लोरेसेंस धुंधला और qPCR एचआरएम प्रयोग में डीएनए की एक समान राशि के साथ डीएनए के एक सटीक निर्धारण का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है (चरण १.२ देखें) । चित्रा 2 ब्याज के डीएनए क्षेत्र के सफल प्रवर्धन को दर्शाता है जहां सभी नमूनों और नियंत्रणों के सीक्यू मूल्य बहुत संकीर्ण अंतराल में होते हैं। एनटीसी कुओं में कोई प्रवर्धन नहीं है।

एचआरएम चरण क्यूपीसीआर के तुरंत बाद चरण 1.11 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जाता है। सक्रिय पिघल क्षेत्रों(चित्रा 3,लेबल (सी)) नमूनों के, नियंत्रण और एनटीसी उनके गठबंधन पिघल वक्र भूखंडों(चित्रा 4)बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । इसलिए, नमूनों में आनुवंशिक वेरिएंट की ठीक से कल्पना और पहचान करने के लिए सही ढंग से सेट पूर्व और बाद के पिघल क्षेत्रों/तापमान लाइनों(चित्रा 3 ए)महत्वपूर्ण हैं । चित्रा 4A और चित्रा 4B क्रमशः गठबंधन पिघल घटता है और अंतर भूखंडों, जहां आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान संभव है दिखाओ । अज्ञात नमूनों को सकारात्मक नियंत्रणों में से एक के साथ कसकर गठबंधन किया जाता है। चित्रा 3B गलत तरीके से पूर्व और बाद पिघल क्षेत्रों/तापमान लाइनों सेट दिखाता है । इसके परिणामस्वरूप एक गठबंधन पिघल वक्र और अंतर भूखंड होते हैं जहां आनुवंशिक वेरिएंट की सही पहचान अधिक कठिन होती है(चित्रा 4C और चित्रा 4D)।

एचआरएम परिणामों की पुष्टि करने और यह पता लगाने के लिए कि नमूने में मौजूद आनुवंशिक संस्करण की पहचान करने के लिए मानक या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधि की आवश्यकता है या नहीं, एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया जाता है। चित्र 7 से पता चलता है कि चित्र 4में प्रदर्शित किए गए उन्हीं नमूनों और नियंत्रणों के एगरॉल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस । नमूने में आनुवंशिक संस्करण को नियंत्रण के लिए नमूने के बैंड पैटर्न की तुलना और एचआरएम और एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के संयोजन से पहचाना जा सकता है। हालांकि, सही आनुवंशिक संस्करण पहचान केवल उन नमूनों के लिए की जा सकती है जिनमें एचआरएम परख(चित्र 7)में उपयोग किए जाने वाले नियंत्रणों में से एक के रूप में एक ही आनुवंशिक संस्करण होता है। दुर्लभ CALR आनुवंशिक वेरिएंट वाले नमूने एचआरएम परिणाम और इलेक्ट्रोफोरेसिस बैंड पैटर्न(चित्रा 8)में भिन्न होते हैं। इस मामले में, सटीक आनुवंशिक संस्करण की पहचान करने के लिए सेंगर अनुक्रमण या यहां तक कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधि का उपयोग किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एचआरएम द्वारा कैलआर जीन में दैहिक आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने के लिए एल्गोरिदम का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और अनुक्रमण विधियों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CALR जीन में आनुवंशिक वेरिएंट का पता लगाने के लिए qPCR HRM परख के प्रवर्धन साजिश । प्रवर्धन भूखंड को निष्क्रिय संदर्भ (एनएआरएन) से फ्लोरेसेंस के लिए सामान्य रूप से और चक्र संख्या के एक समारोह के रूप में कच्चे फ्लोरेसेंस के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। बेसलाइन 3 से 15 चक्रों तक सेट किया जाता है जब ब्याज के डीएनए क्षेत्र को क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के 20 एनजी का उपयोग करके कुशलतापूर्वक परिलक्षित किया गया था । सभी नमूनों के हित के डीएनए क्षेत्र के सामान्य प्रवर्धन भूखंडों को हरी रेखाओं के रूप में दिखाया गया है। भूखंड फ्लोरेसेंस में एक घातीय वृद्धि दिखाते हैं जो क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के 20 एनजी का उपयोग करके प्रयोग में चक्र 15 और ३५ के बीच की सीमा से अधिक है । ग्राफ गैर-टेम्पलेट नमूना कुओं (एनटीसी) में कोई प्रवर्धन नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: CALR जीन में आनुवंशिक वेरिएंट का पता लगाने के लिए QPCR एचआरएम परख में व्युत्पन्न पिघल घटता है ।  A)सही ढंग से पूर्व और पिघलने के बाद के क्षेत्रों/तापमान लाइनों को सही ढंग से सेट करने का एक उदाहरण । पूर्व पिघल बंद तापमान लाइन पिघल संक्रमण क्षेत्र की शुरुआत के निकट होना चाहिए । पिघलने के बाद शुरू तापमान रेखा पिघल संक्रमण क्षेत्र के अंत से सटी होनी चाहिए। (क) लेबल चोटियों के बाईं ओर लाइनों की जोड़ी को इंगित करता है जहां पूर्व पिघल शुरू होता है और तापमान को रोकने के सेट कर रहे हैं । हर एम्प्लीकॉन डबल फंसे हुए हैं । (ख) लेबल गठबंधन पिघल घटता साजिश बनाने के लिए इस्तेमाल सक्रिय पिघल क्षेत्र के डेटा चोटियों को इंगित करता है । (ग) लेबल चोटियों के दाईं ओर लाइनों की जोड़ी को इंगित करता है जहां पिघलने के बाद शुरू होता है और तापमान को रोकता है। हर एम्प्लिकॉन सिंगल-फंसे हुए हैं । B)गलत तरीके से पूर्व और पिघलने के बाद के क्षेत्रों/तापमान लाइनों को सेट करने का एक उदाहरण । पूर्व और बाद पिघल तापमान लाइनों की शुरुआत और रोक पिघल संक्रमण क्षेत्रों के निकट नहीं हैं और एक दूसरे से अलग 0.5 डिग्री सेल्सियस से अधिक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: CALR जीन में आनुवंशिक वेरिएंट का पता लगाने के लिए qPCR HRM परख में गठबंधन पिघल घटता और अंतर भूखंडों ।  A)और बी)पूर्व और बाद पिघल क्षेत्रों/तापमान लाइनों को सही ढंग से सेट करने के बाद गठबंधन पिघल घटता और अंतर भूखंडों को दिखाते हैं । A)52 बीपी विलोपन (टाइप 1 म्यूटेशन), 5 बीपी इंजेशन (टाइप 2 म्यूटेशन) और एक जंगली प्रकार के साथ सकारात्मक नियंत्रणों के गठबंधन पिघल घटता क्रमशः नारंगी, बैंगनी और लाल रंग के रूप में दिखाया गया है। ख) पैनल एमें वर्णित उन्हीं नमूनों की अंतर साजिश । C)और D)नमूनों के एक ही सेट के लिए गलत तरीके से सेट पूर्व और बाद पिघल क्षेत्रों/तापमान लाइनों के बाद गठबंधन पिघल घटता और अंतर भूखंडों को दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम। A)जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम की बुनियादी इकाइयां (सामग्री की तालिकादेखें)। B)फोटो-प्रलेखन प्रणाली के साथ जेल इमेजर जिसमें सीसीडी कैमरा, उपयुक्त ट्रांस/रोशन रोशनी वाला एक कक्ष और एक फोटोग्राफिक फ़िल्टर दिखाया गया है (सामग्री की तालिकादेखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: खाली कुओं के लिए पतला नमूने और डीएनए आकार मानक समाधान या RNase और DNase मुक्त एच2ओ के साथ जेल लोड करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर क्यूपीसीआर एचआरएम उत्पादों का विश्लेषण। जेल यूवी ट्रांसल्यूमिनेटर के संपर्क में था। छवि फोटो प्रलेखन प्रणाली(चित्रा 5B)द्वारा लिया गया था । 1 से 3 शो नियंत्रण: 52 बीपी विलोपन (टाइप 1 म्यूटेशन), 5 बीपी प्रविष्टि (टाइप 2 म्यूटेशन) और जंगली प्रकार के संस्करण, क्रमशः। कुओं में अज्ञात नमूनों का बैंड पैटर्न 4-10 उन्हें जंगली प्रकार के आनुवंशिक संस्करण के रूप में इंगित करता है। एम वेल पतला डीएनए आकार मानक समाधान (100 से 2,000 बीपी) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: केएलआर जीन में आनुवंशिक वेरिएंट के एचआरएम और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण।  A) एचआरएम विश्लेषण करता है। 52 बीपी विलोपन (टाइप 1 उत्परिवर्तन), 5 बीपी प्रविष्टि (टाइप 2 उत्परिवर्तन) और एक जंगली प्रकार के साथ सकारात्मक नियंत्रण के गठबंधन पिघल घटता क्रमशः नारंगी, बैंगनी और लाल रंग के रूप में दिखाया गया है। विभिन्न आनुवंशिक संस्करण के साथ अज्ञात नमूना गहरे नीले रंग के रूप में इंगित किया गया है। B)जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण करता है। 1 से 3 शो नियंत्रण: 52 बीपी विलोपन (टाइप 1 म्यूटेशन), 5 बीपी प्रविष्टि (टाइप 2 म्यूटेशन) और जंगली प्रकार के संस्करण, क्रमशः। लेन 9 में अज्ञात नमूने का बैंड पैटर्न नियंत्रण के रूप में विभिन्न आनुवंशिक संस्करण को इंगित करता है। अन्य अज्ञात नमूने जंगली प्रकार के संस्करण हैं। एम वेल पतला डीएनए आकार मानक समाधान (100 से 2,000 बीपी) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र 9: एचआरएम परख का पता लगाने की सीमा। इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार सेंगर अनुक्रमण विश्लेषण और क्यूपीसीआर एचआरएम परख के अनुसार लगभग 50% के आनुवंशिक संस्करण एलील बोझ को प्रदर्शित करते हुए 52 बीपी विलोपन (टाइप 1 म्यूटेशन) और 5 बीपी प्रविष्टि (टाइप 2 म्यूटेशन) के नमूने का एक धारावाहिक कमजोर पड़ना प्रस्तुत किया गया है। A) और बी)एक ५२ बीपी हटाने (प्रकार 1 उत्परिवर्तन) के जंगली प्रकार और धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए गठबंधन पिघल घटता और अंतर भूखंडों दिखाओ । सी) और डी)एक 5 बीपी प्रविष्टि (प्रकार 2 उत्परिवर्तन) के जंगली प्रकार और धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए गठबंधन पिघल घटता और अंतर भूखंडों दिखाओ । किसी भी मामले में, CALR आनुवंशिक संस्करण 1.56% कमजोर पड़ने तक में पता लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

डीएनए का उच्च-संकल्प पिघलना जेनोटीपिंग और जेनेटिक वैरिएंट स्कैनिंग14के लिए एक सरल समाधान है । यह अनुक्रम मतभेदों पर निर्भर करता है जिसके परिणामस्वरूप हेट्रोडुलेक्स होते हैं जो पिघलने वाले वक्र के आकार को बदलते हैं। कैंसर के रोगियों के एक निश्चित समूह के लिए विशिष्ट जीन में विशिष्ट विभिन्न प्रकार की आनुवांशिक रूप 1,2,15 , 16,10,10देखी जा सकती है । ब्याज के जीन में विलोपन या सम्मिलन का पता एचआरएम विश्लेषण द्वारा लगाया जा सकता है जैसा कि हमने चित्र 4 एमें दर्शाया है । नियमित परीक्षण में क्यूपीसीआर एचआरएम परख के कार्यान्वयन में, हमने 63 वर्ष (24 से 90 वर्ष) की औसत आयु वाले 21 जेएक 2 वी 617एफ-नकारात्मक ईटी रोगियों सहित एक प्रारंभिक मूल्यांकन अध्ययन किया है। CALR जीन में एक आनुवंशिक संस्करण 21 JAK2 V617F-नकारात्मक एट रोगियों (अनुपात ०.५७) में से 12 में पाया गया था । 21 में से 9 में 52 बीपी विलोपन (टाइप 1 म्यूटेशन) (टाइप 1 म्यूटेशन) का पता चला, 21 में से 3 में 5 बीपी इंजर्टेशन (टाइप 2 म्यूटेशन) का पता चला (अनुपात ०.१४३) JAK2 V617F-निगेटिव ईटी मरीजों में । परिणाम साहित्य 1 , 2,17के आंकड़ों के अनुरूप हैं .

एचआरएम विश्लेषण द्वारा आनुवंशिक वेरिएंट की विश्वसनीय पहचान उचित परख विकास के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है जो यह सुनिश्चित करती है कि प्रयोग एचआरएम के लिए अनुकूलित है। अनुक्रम के अलावा अन्य कारक एचआरएम घटता में छोटे अंतर का स्रोत हो सकते हैं जैसे प्राइमर डिजाइन, एम्प्लीकेशन लंबाई, डाई चयन, क्यूपीसीआर एचआरएम रिएजेंट का विकल्प और क्यूपीसीआर एचआरएम चरणों का तापमान और समय प्रोफाइल। यह क्यूपीसीआर एचआरएम परख के प्रारंभिक विकास और अनुकूलन का हिस्सा है और 12,14 ,18अन्य जगहों पर चर्चा हो चुकी है । हालांकि, एक ही प्राइमर सीक्वेंस19का उपयोग करके विभिन्न एचआरएम प्लेटफार्मों पर परख की तुलनीय संवेदनशीलता के साथ CALR जीन में आनुवंशिक वेरिएंट की विश्वसनीय पहचान प्राप्त की जा सकती है। क्यूपीसीआर एचआरएम परख की अनुकूलन प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण बिंदु क्यूपीसीआर एचआरएम परख के क्यूपीसीआर चरण में पिघलने और विस्तार तापमान का अनुकूलन था। एचआरएम स्टेप12के लिए किसी संशोधन की जरूरत नहीं थी . नियमित परीक्षण में, एचआरएम परिणामों को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों का पालन करना अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है।

उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए को कम नमक वाले बफर जैसे टीई (10 एमएम ट्रिस, 1 एमएम ईडीए या कम एकाग्रता) में फिर से निलंबित किया गया और क्यूपीसीआर एचआरएम परख में डीएनए की समान मात्रा क्यूपीसीआर एम्पलीफिकेशन चरण(चित्रा 2)में उच्च सिग्नल पठार के साथ हितों के सफलतापूर्वक परिलक्षित डीएनए क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। इससे एचआरएम विश्लेषण ( चित्र 4 ए ,4बी)12,14द्वारा आनुवंशिक वेरिएंट की विश्वसनीय पहचानहोतीहै । निष्कर्षण प्रोटोकॉल में डीएनए के उन्मूलन के लिए उपयोग किया जाने वाला एक उच्च नमक बफर डीएनए पिघलने संक्रमण के थर्मोडायनामिक्स को आसानी से बदल सकता है। कम नमक वाले बफर ते या नमूने को कमजोर करने में वर्षा और पुनर्स्पिति ण डीएनए नमूने में अशुद्धियों की समस्या को हल कर सकते हैं। कम गुणवत्ता वाले डीएनए गैर-विशिष्ट पीसीआर उत्पादों या असफल प्रवर्धन का उत्पादन कर सकते हैं। इस सब के परिणामस्वरूप एचआरएम संस्करण का पता लगाने में कम प्रजनन क्षमता और उच्च त्रुटि दर हो सकती है। एक इष्टतम एचआरएम परिणामप्राप्तकरने के लिए पैराफिन एम्बेडेड नमूनों से निकाले गए डीएनए जैसे चुनौतीपूर्ण नमूनों के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।

क्यूपीसीआर एचआरएम परख में उपयोग की जाने वाली डीएनए राशि में बड़े अंतर परिणामस्वरूप पिघलने वाले तापमान (टीएम) को प्रभावित कर सकते हैं और परिणामस्वरूप अनिर्णाया परिणाम हो सकते हैं। इसलिए, डीएनए एकाग्रता का सटीक निर्धारण और सभी डीएनए नमूनों को कमजोर करना अनिवार्य है20. पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण और फ्लोरेसेंस धुंधला तरीके उच्च शुद्धता डीएनए समाधान21की सांद्रता को सही ढंग से निर्धारित करते हैं । यूवी अवशोषण विधि A260/A280 और A260/230 पर अनुपात अवशोषण माप प्रदर्शन करके डीएनए समाधान की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, फ्लोरोसेंट स्टेनिंग विधि यूवी अवशोषण विधि की तुलना में डीएनए के क्षरण के प्रति अधिक संवेदनशील है और डीएनए एकाग्रता21को अधिक सटीक रूप से निर्धारित कर सकती है। इसलिए एचआरएम विश्लेषण20 , 21में सभी डीएनए नमूनों के मात्राकरण और कमजोर पड़ने के मानकीकरण के लिए यह अधिक उपयुक्त है .

एमपीएनरोगियोंमें देखे गए सीएएलआर जीन में मुख्य आनुवंशिक वेरिएंट हैं । जैसे-जैसे उत्पाद की लंबाई बदलती है और बढ़ती है, जंगली-प्रकार और विषमगोइगोट घटता के बीच का अंतर छोटा हो जाता है, और संस्करण का पतालगाना कठिन हो जाता है 7। इसलिए, इस तरह के आनुवंशिक संस्करण के स्पष्टीकरण के लिए एक अतिरिक्त विधि का उपयोग किया जाना चाहिए।

एक अच्छा उदाहरण एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस है। यह विभिन्न आकारों के डीएनए के टुकड़ों को अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका है22,23. डीएनए अणुओं को एगर उठे जेल के भीतर आकार से अलग किया जाता है ताकि यात्रा की दूरी इसके आणविक भार24के लोगारिथम के विपरीत आनुपातिक हो . चित्रा 4A, चित्रा 4B और चित्रा 7 उदाहरण दिखाते हैं जहां दो सबसे आम प्रकार के CALR आनुवंशिक संस्करण, 52 बीपी विलोपन और 5 बीपी प्रविष्टि, क्यूपीसीआर एचआरएम और एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणामों के संयोजन से पहचाने जाते हैं। हालांकि, जब एचआरएम परिणाम और एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस बैंड पैटर्न नियंत्रण(चित्रा 8)के रूप में एक अलग आनुवंशिक संस्करण (एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन सहित) का संकेत देता है, तो सटीक आनुवंशिक संस्करण10की पहचान करने के लिए सेंगर अनुक्रमण की अभी भी आवश्यकता होती है।

CALR जीन में दैहिक आनुवंशिक संस्करण का एक निम्न स्तर रोगी के नमूने में मौजूद हो सकता है क्यूपीसीआर एचआरएम की व्याख्या करते हुए, एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सेंगर अनुक्रमण परिणाम अधिक मांग करते हैं, विशेष रूप से परख(चित्रा 9)की पहचान सीमा पर। जंगली प्रकार से भिन्न कोई भी पिघलने वाला वक्र आकार रेखा आनुवंशिक संस्करण को नमूने में मौजूद होने का संकेत देती है। क्यूपीसीआर एचआरएम परख की संवेदनशीलता 5% से कम है(चित्रा 9 और संदर्भ19)और सेंगर अनुक्रमण विधि से अधिक संवेदनशील है, जिसकी संवेदनशीलता 15-20%19बताई गई थी। इन मामलों में, अगली पीढ़ी गहरी अनुक्रमण विधि है कि बड़े अंत्येृप्त का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है और HRM परिणाम की पुष्टि करें । अंत में, एचआरएम विश्लेषण CALR जीन में दैहिक आनुवंशिक वेरिएंट की जीनोटाइपिंग और आनुवंशिक भिन्नता स्कैनिंग के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक संस्करण की पहचान ज्यादातर क्यूपीसीआर एचआरएम परख में उपयोग किए जाने वाले नियंत्रणों पर आधारित होती है। एगरॉल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणामों के साथ एचआरएम परिणामों के संयोजन से अधिक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। अनिर्णायिक परिणामों के मामले में, आनुवंशिक संस्करण की ठीक से पहचान करने के लिए मानक सेंगर अनुक्रमण या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधि का उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक विशेष हेमेटोलॉजी प्रयोगशाला, हेमेटोलॉजी विभाग, आंतरिक चिकित्सा विभाग, विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र जुब्लजाना में सभी अकादमिक विशेषज्ञों और कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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References

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जेनेटिक्स अंक 162 उच्च रिज़ॉल्यूशन पिघलने का विश्लेषण फ्लोरेसेंस-आधारित मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन जेनेटिक वैरिएंट प्री-कास्ट एगरेज्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस इंडेल दैहिक उत्परिवर्तन हेट्रोडुपेक्स स्कैनिंग कैलआरआर
उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण का उपयोग कर <em>CALR</em> जीन में आनुवंशिक संस्करण का पता लगाने
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Pajič, T., Belčič Mikič, T., Podgornik, H., Klun, J., Šućurović, S., Zver, S., Sever, M. Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61642, doi:10.3791/61642 (2020).

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