Single-Cell Electroporation på tværs af forskellige organotypiske Slice Kultur Af Mouse Hippocampal Excitatory og klasse-specifikke hæmmende neuroner
Summary
Præsenteret her er en protokol for enkelt-celle elektroporation, der kan levere gener i både excitatoriske og hæmmende neuroner på tværs af en række in vitro hippocampal skive kultur aldre. Vores tilgang giver præcis og effektiv ekspression af gener i individuelle celler, som kan bruges til at undersøge celle-autonome og intercellulære funktioner.
Abstract
Elektroporation har etableret sig som en kritisk metode til overførsel af specifikke gener til celler for at forstå deres funktion. Her beskriver vi en enkeltcellet elektroporationsteknik, der maksimerer effektiviteten (~ 80%) af in vitro-gentransfekt i excitatoriske og klassespecifikke hæmmende neuroner i musorganotypisk hippocampal skivekultur. Ved hjælp af store glaselektroder, tetrodotoxinholdige kunstige cerebrospinalvæske og milde elektriske impulser leverede vi et gen af interesse i dyrkede hippocampale CA1 pyramide neuroner og hæmmende internuroner. Desuden kunne elektroporation udføres i dyrkede hippocampale skiver op til 21 dage in vitro uden reduktion i transfekteffektivitet, hvilket giver mulighed for undersøgelse af forskellige skivekulturudviklingsstadier. Med stigende interesse for at undersøge geners molekylære funktioner på tværs af en bred vifte af celletyper demonstrerer vores metode en pålidelig og ligetil tilgang til in vitro-gentransfekt i musehjernevæv, der kan udføres med eksisterende elektrofysiologiudstyr og -teknikker.
Introduction
I molekylærbiologi er en af de vigtigste overvejelser for en efterforsker, hvordan man leverer et gen af interesse til en celle eller population af celler for at belyse dens funktion. De forskellige leveringsmetoder kan kategoriseres som enten biologiske (f.eks. en viral vektor), kemisk (f.eks. calciumphosphat eller lipid) eller fysisk (f.eks. elektroporation, mikroinjection eller biolistics)1,2. Biologiske metoder er yderst effektive og kan være celletypespecifikke, men er begrænset af udviklingen af specifikke genetiske værktøjer. Kemiske tilgange er meget kraftige in vitro, men transfekt er generelt tilfældige; Desuden er disse tilgange for det meste forbeholdt primærceller. Af de fysiske tilgange er biolistik den enkleste og nemmeste fra et teknisk synspunkt, men producerer igen tilfældige transfektresultater med en relativt lav effektivitet. For applikationer, der kræver overførsel til specifikke celler uden behov for at udvikle genetiske værktøjer, ser vi mod enkeltcelleelektroporation3,4.
Mens elektroporation kun refererer til feltelektroporation, er der i løbet af de sidste tyve år udviklet flere in vitro- og in vivo-elektroporationsprotokoller med en enkelt celle for at forbedre specificitet og effektivitet5,6,7,hvilket viser, at elektroporation kan bruges til at overføre gener til individuelle celler og derfor kan være ekstremt præcis. Procedurerne er imidlertid teknisk krævende, tidskrævende og relativt ineffektive. Faktisk har nyere papirer undersøgt muligheden for mekaniserede elektroporationsplatforme8,9, som kan bidrage til at fjerne flere af disse barrierer for efterforskere, der er interesseret i at installere sådan robotteknologi. Men for dem, der leder efter enklere midler, er problemerne med elektroporation, nemlig celledød, transfekturesvigt og pipettestopning, fortsat et problem.
Vi har for nylig udviklet en elektroporation metode, der bruger større tippet glas pipetter, mildere elektrisk puls parametre, og et unikt tryk cykling skridt, som genererede en langt højere transfekt effektivitet i excitatoriske neuroner end tidligere metoder, og gjorde det muligt for os for første gang at transfekt gener i hæmmende interneurons, herunder somatostatin-udtrykke hæmmende internurons i hippocampal CA1 region af mus organotypic skive kultur10. Pålideligheden af denne elektroporationsmetode i forskellige hæmmende interneurontyper og neuronale udviklingsstadier er imidlertid ikke blevet behandlet. Her demonstrerede vi, at denne elektroporationsteknik er i stand til at transfektere gener til både excitatoriske neuroner og forskellige klasser af interneuroner. Det er vigtigt, at transfekteffektiviteten var høj, uanset hvilke dage in vitro (DIV) skivekulturalderen blev testet. Denne etablerede og brugervenlige teknik anbefales stærkt til enhver efterforsker, der er interesseret i at bruge enkeltcelleelektroporation til forskellige celletyper i forbindelse med in vitro-musehjernevæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en elektroporationsmetode, der transfects både excitatoriske og hæmmende neuroner med høj effektivitet og præcision. Vores optimerede elektroporationsprotokol har tre innovative gennembrud for at opnå højeffektiv gentransfekt. Vores første ændring var at øge pipettestørrelsen sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller3,5,6. Denne ændring gjorde det muligt for os at elektroporate mange neur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants (R01NS085215 til K.F., T32 GM107000 og F30MH122146 til A.C.). Forfatterne takker Ms Naoe Watanabe for dygtig teknisk bistand.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
