Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.
Abstract
Elektroporatie heeft zich gevestigd als een kritische methode voor het overbrengen van specifieke genen in cellen om hun functie te begrijpen. Hier beschrijven we een eencellige elektroporatietechniek die de efficiëntie (~ 80%) van in vitro gentransfectie in excitatory en klassespecifieke remmende neuronen in muis organotypische hippocampale slice-cultuur maximaliseert. Met behulp van grote glaselektroden, tetrodotoxine-bevattende kunstmatige cerebrospinale vloeistof en milde elektrische pulsen, leverden we een gen van belang in gekweekte hippocampale CA1-piramidale neuronen en remmende interneurons. Bovendien kon elektroporatie worden uitgevoerd in gekweekte hippocampale slices tot 21 dagen in vitro zonder vermindering van de transfectie-efficiëntie, waardoor de ontwikkelingsstadia van de segmentcultuur konden worden bestudeerd. Met de interesse om de moleculaire functies van genen in een breed scala van celtypen te onderzoeken, toont onze methode een betrouwbare en eenvoudige benadering van in vitro gentransfectie in muishersenweefsel die kan worden uitgevoerd met bestaande elektrofysiologische apparatuur en technieken.
Introduction
In de moleculaire biologie is een van de belangrijkste overwegingen voor een onderzoeker hoe een gen van belang in een cel of populatie cellen kan worden afgeleverd om zijn functie op te helderen. De verschillende leveringsmethoden kunnen worden gecategoriseerd als biologisch (bv. een virale vector), chemisch (bv. calciumfosfaat of lipide) of fysisch (bv. elektroporatie, micro-injectie of biolistica)1,2. Biologische methoden zijn zeer efficiënt en kunnen celtypespecifiek zijn, maar worden beperkt door de ontwikkeling van specifieke genetische hulpmiddelen. Chemische benaderingen zijn zeer krachtig in vitro, maar transfecties zijn over het algemeen willekeurig; verder zijn deze benaderingen meestal alleen voorbehouden aan primaire cellen. Van de fysieke benaderingen is biolistics technisch gezien het eenvoudigst en gemakkelijkst, maar produceert opnieuw willekeurige transfectieresultaten met een relatief laag rendement. Voor toepassingen die overdracht naar specifieke cellen vereisen zonder dat we genetische hulpmiddelen hoeven te ontwikkelen, kijken we naar eencellige elektroporatie3,4.
Terwijl elektroporatie in de afgelopen twintig jaar alleen betrekking had op veldelektroporatie, zijn er in de afgelopen twintig jaar meerdere in vitro en in vivo eencellige elektroporatieprotocollen ontwikkeld om specificiteit en efficiëntie5,6,7te verbeteren , wat aantoont dat elektroporatie kan worden gebruikt om genen over te dragen naar individuele cellen en daarom uiterst nauwkeurig kan zijn. De procedures zijn echter technisch veeleisend, tijdrovend en relatief inefficiënt. Recentere artikelen hebben inderdaad de haalbaarheid onderzocht van gemechaniseerde elektroporatieplatforms8,9, die kunnen helpen om verschillende van deze barrières weg te nemen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het installeren van dergelijke robotica. Maar voor degenen die op zoek zijn naar eenvoudigere middelen, blijven de problemen met elektroporatie, namelijk celdood, transfectiefalen en pipetverstopping, een zorg.
We hebben onlangs een elektroporatiemethode ontwikkeld die gebruik maakt van glazen pipetten met grotere punt, mildere elektrische pulsparameters en een unieke drukcyclile stap, die een veel hogere transfectie-efficiëntie in excitatory neuronen genereerde dan eerdere methoden, en ons voor het eerst in staat stelde om genen in remmende interneurons te transfecteren, waaronder somatostatine-uitdrukkende remmende interneurons in het hippocampale CA1-gebied van muisorganotypische plakcultuur10. De betrouwbaarheid van deze elektroporatiemethode in verschillende remmende interneurontypen en neuronale ontwikkelingsstadia is echter niet aangepakt. Hier hebben we aangetoond dat deze elektroporatietechniek in staat is om genen over te zetten in zowel excitatory neuronen als verschillende klassen van interneurons. Belangrijk is dat de transfectie-efficiëntie hoog was, ongeacht de dagen in vitro (DIV) slice culture age getest. Deze gevestigde en gebruiksvriendelijke techniek wordt ten zeerste aanbevolen aan elke onderzoeker die geïnteresseerd is in het gebruik van eencellige elektroporatie voor verschillende celtypen in de context van in vitro muishersenweefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een elektroporatiemethode die zowel excitatory als remmende neuronen met hoge efficiëntie en precisie transfecteert. Ons geoptimaliseerde elektroporatieprotocol heeft drie innovatieve doorbraken om een zeer efficiënte gentransfectie te bereiken. Onze eerste wijziging was om de pipetgrootte te vergroten in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen3,5,6. Deze verandering stelde ons in staat om veel ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants (R01NS085215 to K.F., T32 GM107000 en F30MH122146 to A.C.). De auteurs danken mevrouw Naoe Watanabe voor vakkundige technische bijstand.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
