Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.
Abstract
La electroporación se ha establecido como un método crítico para transferir genes específicos a las células para entender su función. Aquí, se describe una técnica de electroporación unicelular que maximiza la eficiencia (~ 80%) de la transfección genética in vitro en las neuronas inhibitorias excitatorias y específicas de la clase en el cultivo organotípico de la rebanada del hipocampo de ratón. Usando los electrodos de cristal grandes, el líquido cerebroespinal artificial tetrodotoxina-que contenía y los pulsos eléctricos suaves, entregamos un gene del interés en las neuronas piramidales hippocampal cultivadas CA1 y las interneuronas inhibitorias. Por otra parte, la electroporación podría llevarse a cabo en rodajas de hipocampo cultivadas hasta 21 días in vitro sin reducción en la eficiencia de transfección, lo que permite el estudio de diferentes etapas de desarrollo del cultivo en rodajas. Con el creciente interés en examinar las funciones moleculares de los genes a través de una amplia gama de tipos de células, nuestro método demuestra un enfoque confiable y sencillo para la transfección de genes in vitro en el tejido cerebral de ratón que se puede realizar con el equipo y las técnicas de electrofisiología existentes.
Introduction
En biología molecular, una de las consideraciones más importantes para un investigador es cómo entregar un gen de interés en una célula o población de células para dilucidar su función. Los diferentes métodos de administración pueden clasificarse como biológicos (por ejemplo, un vector viral), químicos (por ejemplo, fosfato de calcio o lípidos) o físicos (por ejemplo, electroporación, microinyección o biolística)1,2. Los métodos biológicos son altamente eficientes y pueden ser específicos del tipo celular, pero están limitados por el desarrollo de herramientas genéticas específicas. Los enfoques químicos son muy potentes in vitro, pero las transfecciones son generalmente aleatorias; además, estos enfoques se reservan principalmente para las células primarias solamente. De los enfoques físicos, la biolística es la más simple y fácil desde un punto de vista técnico, pero de nuevo produce resultados de transfección aleatoria con una eficiencia relativamente baja. Para aplicaciones que requieren transferencia a células específicas sin necesidad de desarrollar herramientas genéticas, miramos hacia la electroporación unicelular3,4.
Mientras que la electroporación solía referirse únicamente a la electroporación de campo, en los últimos veinte años se han desarrollado múltiples protocolos de electroporación unicelular in vitro e in vivo para mejorar la especificidad y la eficiencia5,6,7,demostrando que la electroporación puede utilizarse para transferir genes a células individuales y, por lo tanto, puede ser extremadamente precisa. Sin embargo, los procedimientos son técnicamente exigentes, lentos y relativamente ineficientes. De hecho, artículos más recientes han investigado la viabilidad de las plataformas de electroporación mecanizadas8,9,que pueden ayudar a eliminar varias de estas barreras para los investigadores interesados en instalar dicha robótica. Pero para aquellos que buscan medios más simples, los problemas con la electroporación, a saber, la muerte celular, la falla de transfección y la obstrucción de pipetas, siguen siendo una preocupación.
Recientemente desarrollamos un método de electroporación que utiliza pipetas de vidrio de punta más grande, parámetros de pulso eléctrico más suaves y un paso único de ciclo de presión, que generó una eficiencia de transfección mucho mayor en las neuronas excitatorias que los métodos anteriores, y nos permitió por primera vez transfectar genes en interneuronas inhibitorias, incluidas las interneuronas inhibitorias que expresan somatostatina en la región ca1 hipocampal del cultivo de rebanadas organotípicas de ratón10. Sin embargo, la confiabilidad de este método de electroporación en diferentes tipos de interneurona inhibitoria y etapas de desarrollo neuronales no se ha abordado. Aquí, hemos demostrado que esta técnica de electroporación es capaz de transfectar genes en las neuronas excitatorias y diferentes clases de interneuronas. Es importante destacar que la eficiencia de transfección fue alta, independientemente de los días de edad de cultivo en rodajas in vitro (DIV) probados. Esta técnica establecida y fácil de usar es muy recomendable para cualquier investigador interesado en el uso de electroporación unicelular para diferentes tipos de células en el contexto del tejido cerebral de ratón in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos aquí un método de electroporación que transfecta las neuronas excitatorias e inhibitorias con alta eficiencia y precisión. Nuestro protocolo de electroporación optimizado tiene tres avances innovadores para lograr una transfección génica altamente eficiente. Nuestra primera modificación fue aumentar el tamaño de la pipeta en comparación con los protocolos publicados anteriormente3,5,6. Este cambio nos permi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Becas de Salud (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 y F30MH122146 a A.C.). Los autores agradecen a la Sra. Naoe Watanabe su hábil asistencia técnica.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
