Одноклеточная электропорация по различным органотипическим культурам срезов возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронов гиппокампа мыши
Summary
Здесь представлен протокол для одноклеточной электропорации, который может доставлять гены как в возбуждающие, так и в тормозные нейроны в диапазоне возрастов культуры среза гиппокампа in vitro. Наш подход обеспечивает точную и эффективную экспрессию генов в отдельных клетках, которая может быть использована для изучения клеточных автономных и межклеточных функций.
Abstract
Электропорация зарекомендовала себя как критический метод передачи определенных генов в клетки для понимания их функции. Здесь мы описываем метод одноклеточной электропорации, который максимизирует эффективность (~ 80%) трансфекции гена in vitro в возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронах в органотипической культуре среза гиппокампа мыши. Используя большие стеклянные электроды, тетродотоксинсодержащую искусственную спинномозговую жидкость и мягкие электрические импульсы, мы доставили ген, представляющий интерес, в культивируемые пирамидные нейроны ГИПпокампа CA1 и тормозные интернейроны. Кроме того, электропорация может проводиться в культивированных срезах гиппокампа до 21 дня in vitro без снижения эффективности трансфекции, что позволяет изучать различные стадии развития культуры срезов. С ростом интереса к изучению молекулярных функций генов в различных типах клеток наш метод демонстрирует надежный и простой подход к трансфекции генов in vitro в ткани мозга мыши, который может быть выполнен с помощью существующего электрофизиологического оборудования и методов.
Introduction
В молекулярной биологии одним из наиболее важных соображений для исследователя является то, как доставить ген, представляющий интерес, в клетку или популяцию клеток, чтобы прояснить его функцию. Различные способы доставки могут быть классифицированы как биологические (например, вирусный вектор), химические (например, фосфат кальция или липиды) или физические (например, электропорация, микроинъекция или биолистика)1,2. Биологические методы очень эффективны и могут быть специфичными для типа клеток, но ограничены разработкой конкретных генетических инструментов. Химические подходы очень сильны in vitro, но трансфекции, как правило, случайны; кроме того, эти подходы в основном зарезервированы только для первичных клеток. Из физических подходов биолистика является самой простой и легкой с технической точки зрения, но опять же дает случайные результаты трансфекции при относительно низкой эффективности. Для применений, которые требуют переноса в конкретные клетки без необходимости разработки генетических инструментов, мы смотрим на одноклеточную электропорацию3,4.
В то время как электропорация раньше относится только к полевой электропорации, за последние двадцать лет были разработаны множественные протоколы электропорации in vitro и in vivo с одной ячейкой для повышения специфичности и эффективности5,6,7,демонстрируя, что электропорация может использоваться для переноса генов в отдельные клетки и, следовательно, может быть чрезвычайно точной. Однако процедуры технически сложны, трудоемки и относительно неэффективны. Действительно, более поздние работы исследовали целесообразность механизированных электропорационных установок8,9,которые могут помочь устранить некоторые из этих барьеров для исследователей, заинтересованных в установке такой робототехники. Но для тех, кто ищет более простые средства, проблемы с электропорацией, а именно гибель клеток, отказ трансфекции и засорение пипетки, остаются проблемой.
Недавно мы разработали метод электропорации, который использует стеклянные пипетки с большим наконечником, более мягкие параметры электрического импульса и уникальный этап циклического давления, который генерировал гораздо более высокую эффективность трансфекции в возбуждающих нейронах, чем предыдущие методы, и позволил нам впервые трансфектировать гены в ингибирующих интернейронах, включая соматостатин-экспрессирующие ингибирующие интернейроны в области гиппокампа CA1 органотипической культуры срезов мыши10. Однако надежность этого метода электропорации в различных ингибирующих типах интернейронов и стадиях развития нейронов не была рассмотрена. Здесь мы продемонстрировали, что этот метод электропорации способен трансфектировать гены как в возбуждающие нейроны, так и в различные классы интернейронов. Важно отметить, что эффективность трансфекции была высокой независимо от дней in vitro (DIV) среза культуры, проверенных возрастом. Этот установленный и удобный для пользователя метод настоятельно рекомендуется любому исследователю, заинтересованному в использовании одноклеточной электропорации для различных типов клеток в контексте ткани мозга мыши in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод электропорации, который трансфектирует как возбуждающие, так и тормозные нейроны с высокой эффективностью и точностью. Наш оптимизированный протокол электропорации имеет три инновационных прорыва для достижения высокоэффективной трансфекции генов. Наша пер…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Грантами Национальных институтов здравоохранения (R01NS085215 для K.F., T32 GM107000 и F30MH122146 для A.C.). Авторы благодарят г-жу Наоэ Ватанабэ за умелую техническую помощь.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
