Summary

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Published: October 06, 2020
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Summary

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Abstract

A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.

Introduction

Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular3,4.

Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.

Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato10. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.

Protocol

Todos os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. A preparação da cultura de fatias, a preparação plasmida e a eletroporação também estão detalhadas em nossos métodos publicados anteriormente e podem ser encaminhadas para informações adicionais10. 1. Preparação para cultura de fatias Prepare culturas de fatias hipocampai…

Representative Results

Nossa eletroporação unicelular é capaz de fornecer genes precisamente em neurônios excitatórios e inibitórios visualmente identificados. Eletroporamos três tipos diferentes de células neuronais em três pontos de tempo diferentes. Linhas de glutamato parvalbumin (Pv) ou glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) expressando neurônios foram visualizados cruzando linhas decre Pv (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) com linhas repórter TdTomato (uma variante de proteína fluorescente vermelha) (Jax …

Discussion

Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletrop…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 a A.C.). Os autores agradecem à Sra. Naoe Watanabe por assistência técnica hábil.

Materials

Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit Qiagen 12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates GREINER BIO-ONE 657160
Dumont #5/45 Forceps FST #5/45 Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit Millipore SCHVU02RE Filtration and storage of culture media
Incubator Binder BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper TED PELLA, INC. 10180 Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm Millipore PIHP03050 Organotypic slice culture inserts
Osmometer Precision Systems OSMETTE II
PTFE coated spatulas Cole-Parmer SK-06369-11
Scissors FST 14958-09
Stereo Microscope Olympus SZ61
Sterile Vacuum Filtration System Millipore SCGPT01RE Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses Warner Instruments 640796
Micropipetter Puller Sutter Instrument P-1000 Puller
Oven Binder BD (E2)
Puller Filament Sutter Instrument FB330B Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes BD Falcon 353001
Airtable TMC 63-7512E
CCD camera Q Imaging Retiga-2000DC Camera
Electroporation System Molecular Devices Axoporator 800A Electroporator
Fluorescence Illumination System Prior Lumen 200
Manipulator Sutter Instrument MPC-385 Manipulator
Metamorph software Molecular Devices Image acquisition
Peristaltic Pump Rainin Dynamax, RP-2 Perfusion pump
Shifting Table Luigs & Neuman 240 XY
Speaker Unknown Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope Olympus SZ30
Table Top Incubator Thermo Scientific MIDI 40
Upright Microscope Olympus BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710

References

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Cite This Article
Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61662, doi:10.3791/61662 (2020).

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