Summary
Ce protocole présente une méthode améliorée pour obtenir l’hypertrophie myocardique passagère avec la suture absorbable, simulant la diminution ventriculaire gauche d’hypertrophie après avoir enlevé la surcharge de pression. Il pourrait être utile pour les études sur le préconditionnement hypertrophique myocardique.
Abstract
Basé sur des constrictions aortiques deux fois transversales (TACs) chez la souris, il est prouvé que le préconditionnement hypertrophique myocardique (MHP) pourrait atténuer l’hypertrophie cardiomyocyte et ralentir la progression à l’insuffisance cardiaque. Pour les novices, cependant, le modèle MHP est généralement assez difficile à établir en raison des obstacles techniques dans le fonctionnement du ventilateur, l’ouverture de la poitrine à plusieurs reprises, et les saignements causés par la bande. Pour faciliter ce modèle, pour augmenter le taux de réussite chirurgicale et pour réduire l’incidence des saignements, nous sommes passés à des sutures absorbables pour le premier peignage TAC avec une technique sans ventilateur. Utilisant une suture absorbable de 2 semaines, nous avons démontré que cette procédure pourrait causer l’hypertrophie myocardique significative en 2 semaines ; et 4 semaines après chirurgie, l’hypertrophie myocardique a été presque complètement régressée à la ligne de base. En utilisant ce protocole, les opérateurs pourraient maîtriser facilement le modèle MHP avec une mortalité de fonctionnement plus faible.
Introduction
La conditionnement ischémique est un phénomène qui induit de brefs épisodes non létaux d’ischémie et de reperfusion au cœur et a la capacité de réduire considérablement les lésions myocardiques1. Compte tenu des implications cliniques évidentes du préconditionnement ischémique, tels que la limitation de la taille infarctus du myocarde2 et la suppression des tachyarrhythmies ventriculaires après la revascularisation myocardique3, il y a eu beaucoup de recherche pour disséquer les mécanismes sous-jacents aux effets cardio-protecteurs induits par la conditionpréalable 4,5. En revanche, d’autres types non ischémiques de condition préalable ont reçu relativement peu d’attention. L’hypertrophie cardiaque peut être émoussée dans les patients présentant la sténose aortique subissant le remplacement aortique de valve6. Partout où l’état de l’hypertrophie myocardique pathologique existe, le principe de la condition préalable est rarement rapporté.
En 1991, Rockman et coll. ont d’abord établi un modèle muran d’hypertrophie ventriculaire gauche par constriction aortique transversale (TAC)7. En activant le TAC deux fois chez la souris, nous avons précédemment prouvé que le préconditionnement hypertrophique myocardique (MHP) mène à la stimulation hypertrophique passagère dans le coeur rendant ainsi le coeur plus résistant au stress hypertrophique soutenu dans lefutur 8. Les caractéristiques du modèle MHP ont été validées par échographie biomicroscope et évaluation hémodynamique9. Les points clés dans la construction du modèle a été d’effectuer la thoracotomie trois fois, TAC pendant une semaine, la bande pendant une semaine, et tac secondaire pendant 6 semaines. Cependant, la bande pourrait causer des saignements, ce qui rend difficile d’être maîtrisé par les novices et difficile à populariser. En outre, c’est aussi un défi technique d’intuber les souris. Une intubation inappropriée pourrait causer des lésions trachées, du pneumothorax et même la mort chez la souris. Ainsi, il est nécessaire et précieux d’améliorer certaines procédures lors de la construction du modèle MHP.
Pour réduire la difficulté du modèle et augmenter son succès, nous sommes passés à des sutures absorbables pour le premier TAC et avons surveillé le succès du modèle en mesurant le gradient de pression à travers la constriction aortique sous échocardiographie10. Sur la base de notre expérience préliminaire, il serait difficile d’induire une hypertrophie myocardique suffisante chez les souris ayant un gradient de pression trop faible, tandis que les souris avec un gradient de pression trop élevée développeraient une insuffisance cardiaque aiguë ou même mourraient. Le gradient de pression idéal pour le modèle varie de 40-80 mmHg11. En outre, cette expérience ne s’est pas fiée à un ventilateur, qui pourrait effectivement éviter la manipulation technique et les blessures associées auventilateur 12.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées selon les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par les National Institutes of Health des États-Unis (publication n° 85-23 des NIH, révisée en 1996). Des souris mâles C57BL/6J (8-10 semaines, 20-25 g) ont été fournies par le Centre animal de l’université médicale du sud.
1. Préparation préopératoire
- Pincez la pointe d’une aiguille de 25 G avec un porte-aiguille et émoussé avec un objet dur comme le support.
- Passez une suture absorbable 5-0 à travers l’aiguille, puis courbez-la à 90° avec un support13.
REMARQUE : Selon différentes fins de recherche, les chercheurs pourraient sélectionner des lignées absorbables avec un temps d’absorption différent. Dans ce protocole, nous avons utilisé une suture absorbable de 2 semaines pour resserrer l’arc aortique. - Courbez une autre aiguille de 25 G à 120° et lissez la pointe avec un support à utiliser comme espaceur dans l’étape de ligature.
NOTE : Une aiguille de 25 G a été employée comme espaceur pour des souris ayant le poids corporel (BW) et gt;25 g. Utilisez une aiguille de 26 G pour les souris ayant 19-24 g BW. - Désinfecter le site opératoire avec 75% d’alcool.
- Réglez la température du coussin chauffant à 37 °C.
- Préparer des instruments chirurgicaux stérilisés (y compris 1 ciseaux ophtalmiques, 1 micro ciseaux, 2 pinces à coude microchirurgical, 1 porte-aiguilles et 1 micro porte-aiguilles).
2. Induction de l’anesthésie et du rasage
- Anesthésier une souris par injection intrapénitale d’un mélange de xylazine (5 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) dilué dans une solution saline (0,9% de NaCl). Confirmez l’anesthésie complète avec le réflexe négatif de retrait de la pédale.
- Gardez la souris en position supine en fixant les incisives avec une suture et en fixant les membres avec des rubans adhésifs.
- Appliquer de la crème depilatory pour enlever les cheveux sur son cou et xiphoïde. Désinfecter la zone avec de l’iode suivi de 75% d’alcool.
3. Chirurgie
- Faire une incision de plus de 10 mm à la position médiane entre l’encoche supra-sternale et la poitrine avec un scalpel. Ensuite, séparez la peau et le fascia superficiel.
- Identifiez le premier espace intercostal en comptant les côtes de l’angle sternal. Effectuez l’incision dans le premier espace intercostal et aussi près que possible du sternum. Pénétrer brutalement avec des pinces à coude pour ouvrir cet espace.
- Séparez doucement le parenchyme et le thymus jusqu’à ce que l’arc aortique transversaux soit visible.
REMARQUE : N’endommagez pas la plèvre pariétale pour éviter le pneumothorax. - Passez la suture absorbable 5-0 sous l’arc aortique entre l’artère brachiocéphale et l’artère carotide commune gauche avec une aiguille de loquet14. S’il vous plaît assurez-vous que l’artère brachiocéphale, l’artère carotide commune gauche, et l’artère subclavienne gauche sont visibles dans le champ d’opération.
- Placez l’espaceur, préparé à l’étape 1.3, sur l’aorte transversale et effectuez un double nœud sur l’espaceur avec la suture à l’étape 3.4.
REMARQUE : La pointe de l’espaceur doit être émoussée pour éviter d’endommager l’aorte transversale tout en l’enlevant. - Retirer l’espaceur rapidement mais doucement, puis couper les extrémités de la suture.
- Fermez le premier espace intercostal et la peau à l’aide de sutures en nylon 5-0. Désinfecter la peau à nouveau avec 75% d’alcool.
- Placez la souris sur le coussin chauffant pour favoriser la récupération. Injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg, q12h) par voie intrapénithique pendant les 3 premiers jours suivant la chirurgie.
- Retournez la souris dans la cage dans une salle de cycle lumière/obscurité de 12 h lorsqu’elle récupère sa conscience.
- Effectuer une chirurgie simulée identique à toutes les étapes ci-dessus, mais sans la constriction (étape 3.5).
- Effectuez une chirurgie pour le groupe de suture de soie, identique à toutes les étapes ci-dessus, mais en utilisant une suture de soie 5-0 dans l’étape 1.2.
4. Évaluation échocardiographique de la ligature et des mesures réussies
- Effectuer une évaluation échocardiographique le jour (D) 7 après la chirurgie.
- Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane par inhalation pour l’induction, et 1,5% pour maintenir la profondeur de l’anesthésie, avec un taux de flux d’oxygène de 0,5-1 L/min.
- Placez la souris en position supinée sur la plate-forme, maintenue à 37 °C, et collez ses membres à l’électrode.
- Retirer les poils de la poitrine avec une crème depilatory et appliquer un agent de couplage ultrasonique sur la poitrine de la souris.
- Évaluer la constriction aortique transversale à l’l’œil d’une sonde de 30 MHz.
- Inclinez la plate-forme à l’extrême gauche. Gardez la sonde en position verticale et abaissez-la sur la poitrine le long de la ligne parasternale droite. Ensuite, manipulez l’axe X et l’axe Y sous mode B jusqu’à ce que l’arc aortique soit clairement visible.
- Localisez la constriction par mode B pour obtenir la vue aortique de l’arc11. Utilisez le mode Doppler couleur et l’onde pulsée pour mesurer la vitesse de débit maximale et sélectionnez des souris avec une vitesse de plus de 3 000 mm/s comme groupe TAC (les valeurs sont basées sur des expériences préliminaires).
- Calculez le gradient de pression selon la version modifiée de l’équation11 deBernoulli :
gradient de pression = 4 x Vmax2.
REMARQUE : Le gradient de pression idéal pour le modèle de constriction aortique transversale varie de 40 à 80 mmHg11. - Enregistrez les données et les images à l’aide de Cine Store et Frame Store.
- Évaluer les dimensions et la contractilité du ventriculaire gauche (LV) à l’œil d’une sonde de 30 MHz.
- Réinitialisez la plate-forme à la position horizontale. Gardez la sonde à 30° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre par rapport à la ligne parasternale gauche.
- Utilisez le mode B et manipulez X et Y pour obtenir une vue d’axe claire et pleine-longue du coeur.
- Appuyez sur le mode M pour afficher la ligne d’indicateur. Obtenez des images avec Cine Store et Frame Store pour une mesure ultérieure de la dimension de chambre LV, du raccourcissement fractionnel et de l’épaisseur du mur LV.
- Une fois fait, arrêter l’inhalation d’isoflurane et permettre à la souris de récupérer de l’anesthésie. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage dans une salle de cycle clair/sombre de 12 h.
- Sur D14 et D28 après la chirurgie, répétez les étapes ci-dessus pour mesurer les paramètres cardiaques, puis récoltez le cœur pour des études histologiques.
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Representative Results
Dans cette étude, nous avons divisé au hasard 45 souris en trois groupes, la feinte, le groupe de suture de soie, et le groupe absorbable de suture (le nombre de chaque groupe sur D0 (ligne de base), D14, et D28 après TAC était 15, 10, et 5, respectivement). Sur D7, D14, D21, et D28 après la chirurgie, la vitesse de pointe resserrée a été déterminée par échocardiographie. Nous avons constaté que la vitesse du flux sanguin à la constriction était encore supérieure à 3 000 mm/s dans la deuxième semaine suivant le TAC, même si une suture absorbable avait été utilisée pour resserrer l’arc aortique (figure 1A). De plus, le gradient de pression à la constriction du groupe de suture absorbable a été maintenu au-dessus de 40 mmHg en 2 semaines (figure 1B). Fait intéressant, il n’y avait aucune constriction dans la quatrième semaine après la chirurgie, indiquant que la suture absorbable avait été complètement absorbée.
Nous avons également constaté que l’épaisseur postérieure gauche de mur ventriculaire à l’extrémité-diastole a augmenté et le diamètre interne ventriculaire gauche à l’extrémité-diastole a diminué légèrement sur D14 après TAC (figure 2A-C). Il est intéressant que l’épaisseur postérieure gauche de mur ventriculaire à l’extrémité-diastole dans le groupe absorbable de suture ait régressé sensiblement sur D28 après TAC, qui n’a eu aucune différence significative du niveau de ligne de base. De plus, l’utilisation d’une suture absorbable pour fabriquer le modèle n’a pas affecté la fraction d’éjection du ventricule gauche (figure 2D).
Les rapports HW/BW du groupe de suture de soie et du groupe absorbable de suture avaient augmenté de 30% comparés au groupe factice. Sur D28 après TAC, l’hypertrophie myocardique a régressé et le rapport est retomgé au niveau de référence (figure 3A) dans le groupe absorbable de suture, alors que le rapport a augmenté de 64% dans le groupe de suture de soie. Les résultats de la coloration H&E ont également soutenu l’hypertrophie cardiaque (figure 3B). En conclusion, la suture absorbable était appropriée pour causer la stimulation pathologique passagère d’hypertrophie, qui a répondu aux exigences du modèle hypertrophique myocardique de préconditionnement.
Les données quantitatives ont été présentées comme les comparaisons ± SD. Entre l’imposture, la suture de soie et la suture absorbable ont été effectuées à l’aide d’ANOVA uni sensée suivie de la post-hoc de Bonferroni.
Figure 1 : Imagerie doppler à ondes pulsées et résulte de la vitesse maximale et du gradient de pression de la constriction. Sur D0 (ligne de base), D7, D14, D21 et D28 après TAC utilisant la suture de soie ou la suture absorbable, l’arc aortique ou la constriction a été mesuré par un Doppler d’onde pulsée. (A) Imagerie représentative de la vitesse de pointe sur D0 (ligne de base), D14 et D28 après chirurgie dans le groupe de suture de soie et le groupe absorbable de suture. La vitesse de flux sanguin du groupe absorbable de suture est revenue à la ligne de base tandis que la vitesse du groupe de suture de soie était encore supérieure à 3.000 millimètres/s sur D28 après chirurgie. (B) Le gradient de pression a été calculé en fonction de l’équation modifiée de Bernoulli : gradient de pression = 4 x Vmax2 (V= vitesse maximale de pointe). *: p < 0,05 vs sham. #: p < 0,05 vs le groupe de suture de soie (le nombre de chaque groupe sur D0 (de base), D14, et D28 après TAC était de 15, 10, et 5, respectivement). Données présentées comme moyen ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Paramètres ventriculaires gauches de la structure et de la fonction systolique. (A) Imagerie en mode M du ventricule gauche (LV) dans le groupe de suture de soie et le groupe absorbable de suture sur D0 (ligne de base), D14, et D28 après TAC. L’image représentative de l’épaisseur du mur LV à l’extrémité-diastole était d’environ 0,70 mm (D0) à 1,089 mm (D28) dans le groupe de suture de soie. Quant au groupe de suture absorbable, l’épaisseur du mur était d’environ 0,658 mm (D28), ce qui est revenu presque à la ligne de base. (B) Épaisseur postérieure postérieure gauche du mur à l’extrémité-diastole (LVPWd). (C) Diamètre interne ventriculaire gauche à l’extrémité-diastole (LVIDd). (D) Fraction d’éjection ventriculaire gauche (EF). *: p < 0,05 vs l’imposture en même temps (le nombre de chaque groupe sur D0 (de base), D14, et D28 après TAC était de 15, 10, et 5, respectivement). Données présentées comme moyen ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Hypertrophie cardiaque réversible dans le modèle de la condition préconditionnement hypertrophique myocardique. (A) Poids cardiaque (HW) au rapport poids corporel (BW). (B) Tranches histologiques de cœur tachées de H&E (barre d’échelle = 50 μm). Les cardiomyocytes dans le groupe de suture de soie ont été sensiblement agrandis de D14 à D28 tandis que la taille des cellules a la plupart du temps régressé sur D28 dans le groupe absorbable de suture. *: p < 0,05 vs l’imposture en même temps (le nombre de chaque groupe sur D0 (de base), D14, et D28 après TAC était de 15, 10, et 5, respectivement). Données présentées comme moyen ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il y a encore un secteur largement sous-explosé dans le préconditionnement non ischémique cardiaque. Sur la base de nos études précédentes, nous sommes passés à l’utilisation de sutures absorbables pour améliorer le modèle de préconditionnement hypertrophique myocardique.
Dans les rapports précédents, de nombreux chercheurs ont utilisé la suture de soie pour resserrer l’arc aortique8,14,15. La suture de soie était facilement disponible et a été souvent employée pour la suture chirurgicale de blessure, la ligature de tissu, et la fixation de tissu. Dans ce protocole, nous avons remplacé la suture de soie par une suture absorbable pour le premier TAC. Nous avons constaté que la vitesse du flux sanguin dans la constriction atteignait encore 3 000 mm/s ou plus et durait pendant 2 semaines, ce qui était suffisant pour servir de stimulation hypertrophique à long terme. Ensuite, il reviendrait à la ligne de base sur D28. Cependant, il est difficile de contrôler le temps d’absorption des sutures absorbables. Le temps d’absorption est lié au matériau et au lot de suture absorbable, à l’adaptabilité des tissus et à l’étanchéité lors du resserrement. Nous avons constaté plus tôt que plus la constriction était serrée, moins le temps d’absorption, mais en même temps le taux de mortalité des souris augmenterait. Par conséquent, nous avons choisi la vitesse de pointe à environ 3 000 mm/s comme norme, de sorte que le temps d’absorption pourrait être contrôlé dans les 2 semaines et que le taux de survie des souris pourrait également être augmenté. Un point plus significatif était que l’utilisation des sutures absorbables pourrait réduire les temps d’ouverture de coffre à deux fois, qui ont réduit la difficulté dans la chirurgie et ont augmenté le taux de succès du modèle.
Un ventilateur est habituellement nécessaire pour le soutien de vie des souris pendant la chirurgie. Il est rapporté que l’arc aortique des souris pourrait être resserré sans ventilateur utilisant l’approche suprasternal de fossa15. Cependant, ceci a exigé couper le sternum des souris, qui pourrait prolonger le temps chirurgical de rétablissement. Dans cette étude, nous avons choisi cette approche : constriction du premier espace intercostal près du sternum, pour effectuer la chirurgie. Il s’agissait d’une approche mini-invasive par thoracotomielatérale 14. Étonnamment, nous pourrions effectuer TAC sans ventilateur si l’incision était aussi proche que possible du sternum. Cette approche pourrait également éviter efficacement la manipulation technique associée au ventilateur et les blessures12. En outre, entrant dans le mediastinum des souris par l’incision, l’arc aortique a été exposé clairement parce qu’il n’y avait presque aucune interférence avec les tissus thymiques et d’autres vaisseaux sanguins dans le domaine chirurgical.
Bien qu’il soit commode de ne pas employer un ventilateur pendant toute l’opération, la méthode améliorée porte toujours le risque de pneumothorax provoqué par des dommages pleurals. Il ya quelques suggestions, qui peuvent être utiles pour éviter d’endommager la plèvre. Émousser le bout de l’aiguille autant que possible. Après être entré dans le mediastinum, gardez le bout de la pince à coude aussi vertical que possible pendant toute l’opération. Pendant la ligature, placez l’espaceur dans le mediastinum le long de la ligne médiane antérieure.
En résumé, nous avons amélioré un modèle de souris de l’hypertrophie myocardique et de la régression utilisant des sutures absorbables, qui pourraient avoir beaucoup d’applications potentielles en établissant le modèle de la conditionnement hypertrophique myocardique, explorant le mécanisme de régression d’hypertrophie, et étudiant le temps du remodelage réversible ventriculaire gauche, et ainsi de suite.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81770271; à Y, Liao), des Fonds conjoints de la National Natural Science Foundation of China (U1908205; à Y, Liao) et des Projets municipaux de planification de la technologie scientifique de Guangzhou (201804020083; au Dr Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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