Summary
Questo protocollo presenta un metodo migliorato per ottenere ipertrofia miocardica transitoria con sutura assorbibile, simulando la diminuzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra dopo aver rimosso il sovraccarico di pressione. Potrebbe essere prezioso per gli studi sulla precondizione ipertrofica miocardica.
Abstract
Sulla base di costrizioni aortiche due volte trasversali (TAC) nei topi, è dimostrato che il precondizione ipertrofica miocardica (MHP) potrebbe attenuare l'ipertrofia cardiomiocitaria e rallentare la progressione all'insufficienza cardiaca. Per i principianti, tuttavia, il modello MHP è solitamente abbastanza difficile da stabilire a causa degli ostacoli tecnici nel funzionamento del ventilatore, aprendo ripetutamente il torace e sanguinando causato dallo scioglimento. Per facilitare questo modello, per aumentare il tasso di successo chirurgico e ridurre l'incidenza del sanguinamento, siamo passati a suture assorbibili per la prima pettinatura TAC con una tecnica senza ventilatore. Utilizzando una sutura assorbibile di 2 settimane, abbiamo dimostrato che questa procedura potrebbe causare una significativa ipertrofia miocardica in 2 settimane; e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico, l'ipertrofia miocardica è stata quasi completamente regredito alla linea di base. Utilizzando questo protocollo, gli operatori potrebbero padroneggiare facilmente il modello MHP con una minore mortalità operativa.
Introduction
Il precondizione ischemica è un fenomeno che induce brevi episodi non letali di ischemia e riperfusione al cuore e ha la capacità di ridurre drasticamente la lesione miocardica1. Date le ovvie implicazioni cliniche della precondizione ischemica, come la limitazione della dimensione dell'infarto del miocardio2 e la soppressione delle tachiaritmie ventricolari dopo la rivascolarizzazione del miocardio3,ci sono state molte ricerche per sezionare i meccanismi alla base degli effetti cardioprotettivi indotti dalla precondizione4,5. Al contrario, altri tipi non ischemici di precondizione hanno ricevuto relativamente poca attenzione. L'ipertrofia cardiaca può essere smussata in pazienti con stenosi aortica sottoposta a sostituzione della valvola aortica6. Ovunque esista lo stato di ipertrofia miocardica patologica, il principio della precondizione è raramente riportato.
Nel 1991, Rockman et al. Operando il TAC due volte nei topi, abbiamo precedentemente dimostrato che la precondizione ipertrofica miocardica (MHP) porta a una stimolazione ipertrofica transitoria nel cuore rendendo così il cuore più resistente allo stress ipertrofico sostenuto in futuro8. Le caratteristiche del modello MHP sono state convalidate dal biomicroscopio ad ultrasuoni e dalla valutazione emodinamica9. I punti chiave nella costruzione del modello sono stati l'esecuzione della toracotomia tre volte, del TAC per una settimana, dello scioglimento per una settimana e del TAC secondario per 6 settimane. Tuttavia, lo scioglimento potrebbe causare sanguinamento, il che ha reso difficile essere padroneggiati dai novizi e difficile da popolare. Inoltre, è anche una sfida tecnica per intubare i topi. Un'intubazione impropria potrebbe causare lesioni tracheali, pneumotorace e persino morte nei topi. Pertanto, è necessario e prezioso migliorare alcune procedure durante la costruzione del modello MHP.
Per ridurre la difficoltà del modello e aumentarne il successo, siamo passati alle suture assorbibili per il primo TAC e monitorato il successo del modello misurando il gradiente di pressione attraverso la costrizione aortica sotto ecocardiografia10. Sulla base del nostro esperimento preliminare, sarebbe difficile indurre un'ipertrofia miocardica sufficiente nei topi con gradiente di pressione troppo bassa, mentre i topi con gradiente di pressione troppo alta svilupperanno insufficienza cardiaca acuta o addirittura morirebbero. Il gradiente di pressione ideale per il modello varia da 40 a 80 mmHg11. Inoltre, questo esperimento non si basava su un ventilatore, che poteva effettivamente evitare manipolazioni tecniche associate al ventilatore e lesioni12.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida della cura e dell'uso degli animali da laboratorio pubblicate dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione n. 85-23 del NIH, rivista nel 1996). I topi maschi C57BL/6J (8-10 settimane, 20-25 g) sono stati forniti dall'Animal Center della South Medical University.
1. Preparazione preoperatoria
- Pizzicare la punta di un ago da 25 G con un portaaghi e smussarlo con un oggetto duro come il supporto.
- Passare una sutura assorbibile 5-0 attraverso l'ago e quindi curvarla a 90° con un supporto13.
NOTA: Secondo diversi scopi di ricerca, gli investigatori potrebbero selezionare linee assorbibili con tempi di assorbimento diversi. In questo protocollo, abbiamo usato una sutura assorbibile di 2 settimane per restringere l'arco aortico. - Curvare un altro ago da 25 G a 120° e levigare la punta con un supporto da utilizzare come distanziale nella fase di legatura.
NOTA: Un ago da 25 G è stato utilizzato come distanziale per topi con peso corporeo (BW) >25 g. Utilizzare un ago da 26 G per topi con 19-24 g di BW. - Disinfettare il sito operativo con il 75% di alcol.
- Regolare la temperatura del pad di riscaldamento a 37 °C.
- Preparare strumenti chirurgici sterilizzati (tra cui 1 forbice oftalmica, 1 micro forbici, 2 pinzette microchirurgiche al gomito, 1 portaaghi e 1 micro portaaghi).
2. Induzione di anestesia e rasatura
- Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di xiazina (5 mg/kg) e chetamina (100 mg/kg) diluita in soluzione salina (0,9% NaCl). Confermare l'anestesia completa con il riflesso negativo di prelievo del pedale.
- Mantenere il mouse in posizione supina fissando gli incisivi con una sutura e fissando gli arti con nastri adesivi.
- Applicare la crema depilatoria per rimuovere i capelli sul collo e sullo xifoide. Disinfettare l'area con iodio seguito dal 75% di alcol.
3. Chirurgia
- Fare un'incisione di oltre 10 mm nella posizione della linea mediana tra tacca sovra-sternale e petto con bisturi. Quindi, separare la pelle e la fascia superficiale.
- Identificare il primo spazio intercostale contando le costole dall'angolo sternale. Eseguire l'incisione nel primo spazio intercostale e il più vicino possibile allo sterno. Penetralo senza mezzi termini con una pinzetta a gomito per aprire questo spazio.
- Separare delicatamente il parenchima e il timo fino a quando l'arco aortico trasversale non è visibile.
NOTA: Non danneggiare la pleura parietale per evitare lo pneumotorace. - Passa la sutura assorbibile 5-0 sotto l'arco aortico tra l'arteria brachiocefalica e l'arteria carotide comune sinistra con un ago di chiusura14. Assicurati che l'arteria brachiocefalica, l'arteria carotide comune sinistra e l'arteria succlavia sinistra siano visibili nel campo operativo.
- Posizionare il distanziale, preparato nel passaggio 1.3, sull'aorta trasversale ed eseguire un doppio nodo sul distanziale con la sutura nel passaggio 3.4.
NOTA: La punta del distanziale deve essere smussata per evitare di danneggiare l'aorta trasversale durante la rimozione. - Rimuovere il distanziale rapidamente ma delicatamente, quindi tagliare le estremità della sutura.
- Chiudi il primo spazio intercostale e la pelle usando 5-0 suture di nylon. Disinfettare di nuovo la pelle con il 75% di alcol.
- Posizionare il mouse sulla pastiglia riscaldante per favorire il recupero. Iniettare buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) per via intraperitoneale per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Riportare il mouse nella gabbia in una stanza a ciclo chiaro / scuro di 12 ore quando recupera conoscenza.
- Eseguire un intervento chirurgico fittizio identico a tutti i passaggi precedenti ma senza la costrizione (passaggio 3.5).
- Eseguire un intervento chirurgico per il gruppo di sutura di seta, identico a tutti i passaggi precedenti ma utilizzando una sutura di seta 5-0 nel passaggio 1.2.
4. Valutazione ecocardiografica della legatura e delle misurazioni di successo
- Eseguire la valutazione ecocardiografica il giorno (D) 7 dopo l'intervento chirurgico.
- Anestetizzare il topo con il 3% di isoflurane per inalazione per induzione e l'1,5% per mantenere la profondità dell'anestesia, con una portata di ossigeno di 0,5-1 L/min.
- Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma, mantenuto a 37 °C, e rastreliare gli arti sull'elettrodo.
- Rimuovere i peli del petto con una crema depilatoria e applicare l'agente di accoppiamento ad ultrasuoni sul petto del topo.
- Valutare la costrizione aortica trasversale con una sonda a 30 MHz.
- Inclinare la piattaforma all'estrema sinistra. Mantenere la sonda in posizione verticale e abbassarla sul petto lungo la linea parasternale destra. Quindi, manipolare l'asse X e l'asse Y in modalità B fino a quando l'arco aortico non è chiaramente visibile.
- Individuare la costrizione in modalità B per ottenere la vista ad arco aortico11. Utilizzare la modalità Doppler a colori e l'onda pulsata per misurare la velocità del flusso di picco e selezionare i topi con una velocità superiore a 3.000 mm/s come gruppo TAC (i valori si basano su esperimenti preliminari).
- Calcolare il gradiente di pressione secondo la versione modificata dell'equazione11 diBernoulli:
gradiente di pressione = 4 x Vmax2.
NOTA: Il gradiente di pressione ideale per il modello di costrizione aortica trasversale varia da 40 a 80 mmHg11. - Salvare i dati e le immagini utilizzando Cine Store e Frame Store.
- Valutare le dimensioni e la contrattilità del ventricolare sinistro (LV) con una sonda a 30 MHz.
- Reimpostare la piattaforma in posizione orizzontale. Mantenere la sonda a 30° in senso antiorario rispetto alla linea parasternale sinistra.
- Utilizzare la modalità B e manipolare X e Y per ottenere una vista dell'asse chiara e a lungo termine del cuore.
- Premere la modalità M per visualizzare la linea dell'indicatore. Acquisire immagini con Cine Store e Frame Store per una successiva misurazione della dimensione della camera LV, dell'accorciamento frazionato e dello spessore della parete LV.
- Una volta fatto, interrompere l'inalazione di isoflurane e consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia. Quindi, riportare l'animale nella sua gabbia in una stanza del ciclo chiaro / scuro di 12 ore.
- Su D14 e D28 dopo l'intervento chirurgico, ripetere i passaggi precedenti per misurare i parametri cardiaci e quindi raccogliere il cuore per studi istologici.
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Representative Results
In questo studio, abbiamo diviso casualmente 45 topi in tre gruppi, la farsa, il gruppo di sutura di seta e il gruppo di sutura assorbibile (il numero di ogni gruppo su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo il TAC era rispettivamente 15, 10 e 5). Su D7, D14, D21 e D28 dopo l'intervento chirurgico, la velocità di picco ristretta è stata determinata dall'ecocardiografia. La Corte ha riscontrato che la velocità del flusso sanguigno alla costrizione era ancora superiore a 3.000 mm/s nella seconda settimana dopo il TAC, anche se una sutura assorbibile era stata utilizzata per restringere l'arco aortico(figura 1A). Inoltre, il gradiente di pressione alla costrizione del gruppo di sutura assorbibile è stato mantenuto al di sopra di 40 mmHg in 2 settimane(figura 1B). È interessante notare che non c'era costrizione nella quarta settimana dopo l'intervento chirurgico, indicando che la sutura assorbibile era stata completamente assorbita.
La Corte ha inoltre riscontrato che lo spessore della parete posteriore ventricolare sinistra al diastolo finale è aumentato e il diametro interno ventricolare sinistro al diastole finale è leggermente diminuito rispetto al D14 dopo il TAC(Figura 2A-C). È interessante notare che lo spessore della parete posteriore ventricolare sinistra al diastole finale nel gruppo di sutura assorbibile regredì sostanzialmente su D28 dopo il TAC, che non aveva differenze significative rispetto al livello di base. Inoltre, l'uso di sutura assorbibile per realizzare il modello non ha influito sulla frazione di espulsione del ventricolo sinistro (Figura 2D).
I rapporti HW / BW del gruppo di sutura di seta e del gruppo di sutura assorbibile erano aumentati del 30% rispetto al gruppo sham. Sul D28 dopo il TAC, l'ipertrofia del miocardio è regredito e il rapporto è sceso al livello di base (Figura 3A) nel gruppo di sutura assorbibile, mentre il rapporto è aumentato del 64% nel gruppo della sutura di seta. I risultati della colorazione H&E supportato anche dall'ipertrofia cardiaca (Figura 3B). In conclusione, la sutura assorbibile era adatta a causare una stimolazione dell'ipertrofia patologica transitoria, che soddisfare i requisiti del modello di precondizione ipertrofica miocardica.
I dati quantitativi sono stati presentati come il mezzo ± SD. I confronti tra la farsa, la sutura di seta e la sutura assorbibile sono stati eseguiti utilizzando ANOVA uni-way seguito dal post-hoc di Bonferroni.
Figura 1: Imaging Doppler ad onda pulsata e risultati dalla velocità di picco e dal gradiente di pressione della costrizione. Su D0 (linea di base), D7, D14, D21 e D28 dopo il TAC usando sutura di seta o sutura assorbibile, l'arco aortico o la costrizione è stato misurato da un Doppler ad onda pulsata. (A) Imaging rappresentativo della velocità di picco su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo l'intervento chirurgico nel gruppo della sutura di seta e nel gruppo di sutura assorbibile. La velocità del flusso sanguigno del gruppo di sutura assorbibile tornò alla linea di base mentre la velocità del gruppo della sutura di seta era ancora maggiore di 3.000 mm/s su D28 dopo l'intervento chirurgico. (B) Il gradiente di pressione è stato calcolato secondo l'equazione di Bernoulli modificata: gradiente di pressione = 4 x Vmax2 (V= velocità massima di picco). *: p < 0,05 vs sham. #: p < 0,05 rispetto al gruppo della sutura di seta (il numero di ogni gruppo su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo il TAC era rispettivamente 15, 10 e 5). Dati presentati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Parametri ventricolari sinistro della struttura e della funzione sistolica. (A) Imaging in modalità M dal ventricolo sinistro (LV) nel gruppo di sutura di seta e gruppo di sutura assorbibile su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo tac. L'immagine rappresentativa dello spessore della parete LV alla diastole finale era di circa 0,70 mm (D0) a 1,089 mm (D28) nel gruppo della sutura di seta. Per quanto riguarda il gruppo di sutura assorbibile, lo spessore della parete era di circa 0,658 mm (D28), che è tornato quasi alla linea di base. (B) Spessore sinistro della parete posteriore ventricolare a fine diastole (LVPWd). (C) Diametro interno ventricolare sinistro alla diastole finale (LVIDd). (D) Frazione di espulsione ventricolare sinistra (EF). *: p < 0,05 vs la sham contemporaneamente (il numero di ogni gruppo su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo il TAC era rispettivamente 15, 10 e 5). Dati presentati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ipertrofia cardiaca reversibile nel modello di precondizione ipertrofica miocardica. (A) Rapporto peso cardiaco (HW) e peso corporeo (BW). (B) Fette istologiche di cuore macchiate di H&E (barra di scala = 50 μm). I cardiomiociti nel gruppo della sutura di seta sono stati significativamente ingranditi da D14 a D28 mentre le dimensioni delle cellule sono per lo più regredite su D28 nel gruppo di sutura assorbibile. *: p < 0,05 vs la sham contemporaneamente (il numero di ogni gruppo su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo il TAC era rispettivamente 15, 10 e 5). Dati presentati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
C'è ancora un'area ampiamente sottoesplorato nella precondizione cardiaca non ischemica. Sulla base dei nostri studi precedenti, siamo passati all'uso di suture assorbibili per migliorare il modello di precondizione ipertrofica miocardica.
Nei rapporti precedenti, molti investigatori usavano la sutura di seta per restringere l'arcoaortico 8,14,15. La sutura di seta era facilmente disponibile ed era spesso usata per la sutura chirurgica delle ferite, la legatura dei tessuti e la fissazione dei tessuti. In questo protocollo, abbiamo sostituito la sutura di seta con sutura assorbibile per il primo TAC. Abbiamo scoperto che la velocità del flusso sanguigno nella costrizione raggiungeva ancora i 3.000 mm/s o più ed è durata 2 settimane, il che è stato sufficiente a servire come stimolazione ipertrofica a lungo termine. Quindi, tornerebbe alla linea di base su D28. Tuttavia, è difficile controllare il tempo di assorbimento delle suture assorbibili. Il tempo di assorbimento è correlato al materiale e al lotto di sutura assorbibile, adattabilità dei tessuti e tenuta durante la costrizione. Abbiamo scoperto in precedenza che più stretta è la costrizione, meno è il tempo di assorbimento, ma allo stesso tempo il tasso di mortalità dei topi aumenterebbe. Pertanto, abbiamo selezionato la velocità di picco a circa 3.000 mm/s come standard, in modo che il tempo di assorbimento potesse essere controllato entro 2 settimane e anche il tasso di sopravvivenza dei topi potesse essere aumentato. Un punto più significativo era che l'uso di suture assorbibili poteva ridurre i tempi di apertura del torace a due volte, il che riduceva la difficoltà nell'intervento chirurgico e aumentava il tasso di successo del modello.
Di solito è necessario un ventilatore per il supporto di vita dei topi durante l'intervento chirurgico. È stato riferito che l'arco aortico dei topi potrebbe essere ristretto senza un ventilatore usando l'approccio fossa soprasternale15. Tuttavia, ciò richiedeva il taglio dello sterno dei topi, che potrebbe prolungare il tempo di recupero chirurgico. In questo studio, abbiamo selezionato questo approccio: costrizione del primo spazio intercostale vicino allo sterno, per eseguire l'intervento chirurgico. Questo è stato un approccio minimamente invasivo attraverso la toracotomialaterale 14. Sorprendentemente, potremmo eseguire TAC senza un ventilatore se l'incisione fosse il più vicina possibile allo sterno. Questo approccio potrebbe anche evitare efficacemente la manipolazione tecnica associata al ventilatore e lelesioni 12. Inoltre, entrando nel mediastino dei topi attraverso l'incisione, l'arco aortico è stato esposto chiaramente perché non c'era quasi alcuna interferenza con i tessuti timici e altri vasi sanguigni nel campo chirurgico.
Sebbene sia conveniente non utilizzare un ventilatore durante l'intera operazione, il metodo migliorato comporta ancora il rischio di pneumotorace causato da lesioni pleurici. Ci sono alcuni suggerimenti, che possono essere utili per evitare di danneggiare la pleura. Smussare il più possibile la punta dell'ago. Dopo essere entrato nel mediastino, tenere la punta delle pinzette del gomito il più verticale possibile durante l'intera operazione. Durante la legatura, posizionare il distanziale nel mediastino lungo la linea mediana anteriore.
In sintesi, abbiamo migliorato un modello di topo di ipertrofia e regressione miocardica usando suture assorbibili, che potrebbero avere molte potenziali applicazioni nello stabilire il modello di precondizione ipertrofica miocardica, esplorare il meccanismo di regressione dell'ipertrofia e indagare il tempo di rimodellamento reversibile ventricolare sinistro e così via.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81770271; a Y, Liao), dai Fondi Congiunti della National Natural Science Foundation of China (U1908205; a Y, Liao) e dai Progetti di Pianificazione Municipale di Tecnologia Scientifica di Guangzhou (201804020083; al Dott. Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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