Summary
Denne protokollen presenterer en forbedret metode for å oppnå forbigående myokardhypertrofi med absorberbar sutur, og simulere venstre ventrikulær hypertrofireduksjon reduseres etter fjerning av trykkoverbelastning. Det kan være verdifullt for studiene på myokard hypertrofisk forutsetning.
Abstract
Basert på to ganger tverrgående aorta innsnevringer (TACs) hos mus, er det bevist at myokard hypertrofisk forutsetning (MHP) kan dempe kardiomyocytt hypertrofi og bremse progresjonen til hjertesvikt. For nybegynnere er IMIDLERTID MHP-modellen vanligvis ganske vanskelig å etablere på grunn av de tekniske hindringene i respiratoroperasjonen, åpner brystet gjentatte ganger og blødning forårsaket av debanding. For å lette denne modellen, for å øke den kirurgiske suksessraten og for å redusere forekomsten av blødning, byttet vi til absorberbare suturer for den første TAC-kammen med en respiratorfri teknikk. Ved hjelp av en 2-ukers absorberbar sutur viste vi at denne prosedyren kan forårsake betydelig myokardhypertrofi om 2 uker; og 4 uker etter operasjonen ble myokardhypertrofi nesten helt regressert til baseline. Ved hjelp av denne protokollen kunne operatørene enkelt mestre MHP-modellen med lavere driftsdødelighet.
Introduction
Iskemisk forutsetning er et fenomen som induserer korte ikke-dødelige episoder av iskemi og reperfusjon til hjertet og har kapasitet til å dramatisk redusere hjerteinfarkt1. Gitt de åpenbare kliniske implikasjonene av iskemisk forutsetning, for eksempel å begrense hjerteinfarkt størrelse2 og undertrykke ventrikulære takyktige takyrhythmier etter myokardrekulalisering3, har det vært mye forskning for å dissekere mekanismene som ligger til grunn for kardiobeskyttende effekter indusert av prekondisjonering4,5. I motsetning har andre ikke-iskemiske typer forutsetninger fått relativt liten oppmerksomhet. Hjertehypertrofi kan bli sløvt hos pasienter med aortastenose som gjennomgår aortaventilerstatning6. Uansett hvor tilstanden til patologisk myokardhypertrofi eksisterer, rapporteres prinsippet om forutsetning sjelden.
I 1991 etablerte Rockman et al. først en musemodell av venstre ventrikulær hypertrofi ved tverrgående aortainnsnevring (TAC)7. Ved å operere TAC to ganger hos mus, har vi tidligere bevist at myokard hypertrofisk forutsetning (MHP) fører til forbigående hypertrofisk stimulering i hjertet og dermed gjør hjertet mer motstandsdyktig mot vedvarende hypertrofisk stress i fremtiden8. Egenskapene til MHP-modellen er validert ved ultralydbiomikroskop og hemodynamisk vurdering9. Viktige punkter i konstruksjonen av modellen var å utføre thoracotomy tre ganger, TAC i en uke, debanding i en uke og sekundær TAC i 6 uker. Debanding kan imidlertid forårsake blødning, noe som gjorde det vanskelig å bli mestret av nybegynnere og vanskelig å bli popularisert. I tillegg er det også en teknisk utfordring å intubere mus. Feil intubasjon kan forårsake trakeal skade, pneumothorax og til og med død hos mus. Så det er nødvendig og verdifullt å forbedre noen prosedyrer mens du konstruerer MHP-modellen.
For å redusere modellens vanskelighetsgrader og øke suksessen byttet vi til absorberbare suturer for den første TAC og overvåket modellens suksess ved å måle trykkgradient over den aorta innsnevring under ekkokardiografi10. Basert på vårt foreløpige eksperiment ville det være vanskelig å indusere tilstrekkelig myokardhypertrofi hos mus med for lavtrykksgradient, mens mus med for høytrykksgradient ville utvikle akutt hjertesvikt eller til og med dø. Den ideelle trykkgradienten for modellen varierer fra 40–80 mmHg11. I tillegg var dette eksperimentet ikke avhengig av en respirator, som effektivt kunne unngå respiratorrelatert teknisk manipulasjon og skade12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført etter retningslinjene for pleie og bruk av laboratoriedyr publisert av US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidert i 1996). C57BL/6J hannmus (8–10 uker, 20–25 g) ble levert av Dyresenteret ved South Medical University.
1. Preoperativ forberedelse
- Klyp av spissen på en 25 G nål med en nåleholder og stum den med en hard gjenstand som holderen.
- Før en 5–0 absorberbar sutur gjennom nålen og kurve den deretter til 90° med en holder13.
MERK: I henhold til ulike forskningsformål kan etterforskere velge absorberbare linjer med forskjellig absorpsjonstid. I denne protokollen brukte vi en 2-ukers absorberbar sutur for å begrense aortabuen. - Bøy en annen 25 G nål til 120° og glatt spissen med en holder som skal brukes som avstandsstykke i ligasjonstrinnet.
MERK: En 25 G nål ble brukt som avstandsstykke for mus som hadde kroppsvekt (BW) >25 g. Bruk en 26 G nål til mus med 19–24 g BW. - Desinfiser det operative stedet med 75% alkohol.
- Juster oppvarmingsputetemperaturen til 37 °C.
- Forbered steriliserte kirurgiske instrumenter (inkludert 1 oftalmisk saks, 1 mikrosaks, 2 mikrokirurgiske albue pinsett, 1 nåleholder og 1 mikronålholder).
2. Induksjon av anestesi og barbering
- Bedøv en mus ved intraperitoneal injeksjon av en blanding av xylazin (5 mg/kg) og ketamin (100 mg/kg) fortynnet i saltoppløsning (0,9 % NaCl). Bekreft fullstendig bedøvelse med den negative pedaluttaksfleksen.
- Hold musen i liggende stilling ved å feste snittene med en sutur og feste lemmer med tape.
- Påfør depilatorisk krem for å fjerne hår på nakken og xiphoid. Desinfiser området med jod etterfulgt av 75% alkohol.
3. Kirurgi
- Lag et snitt over 10 mm i midtlinjeposisjon mellom supra-sternal hakk og bryst med en skalpell. Deretter skiller du huden og den overfladiske fascia.
- Identifiser det første intercostalrommet ved å telle ribbenene fra brystvinkelen. Utfør snittet i det første intercostalrommet og så nært som mulig til brystbenet. Penetrer det direkte med albue pinsett for å åpne dette rommet.
- Separer forsiktig parenchyma og tymus til den tverrgående aortabuen er synlig.
MERK: Ikke skad parietal pleura for å unngå pneumothorax. - Pass den 5-0 absorberbare suturen under aortabuen mellom brachiocephalic arterien og venstre vanlig halspulsåre med en låse nål14. Forsikre deg om at brachiocephalic arterien, venstre vanlig halspulsåre, og venstre subklavisiske arterie er synlige i operasjonsfeltet.
- Plasser avstandsstykket, fremstilt i trinn 1.3, på tverrgående aorta og utfør en dobbel knute på avstandsstykken med suturen i trinn 3.4.
MERK: Spissen på avstandsstykken må være stump for å unngå å skade den tverrgående aortaen mens du fjerner den. - Fjern avstandsstykket raskt, men forsiktig, og klipp deretter endene av suturen.
- Lukk det første intercostalrommet og huden ved hjelp av 5-0 nylon suturer. Desinfiser huden igjen med 75% alkohol.
- Plasser musen på varmeputen for å fremme utvinning. Injiser buprenorfin (0,1 mg/kg, q12h) intraperitonealt de første 3 dagene etter operasjonen.
- Returner musen til buret i et 12 timers lys / mørkt syklusrom når det gjenoppretter bevisstheten.
- Utfør sham kirurgi identisk med alle trinnene ovenfor, men uten innsnevring (trinn 3.5).
- Utfør kirurgi for silke sutur gruppen, identisk med alle de ovennevnte trinnene, men ved hjelp av en 5-0 silke sutur i trinn 1.2.
4. Ekkokardiografisk vurdering av vellykket ligasjon og målinger
- Utfør ekkokardiografisk vurdering på dag (D) 7 etter operasjonen.
- Bedøv musen med 3% isofluran gjennom innånding for induksjon, og 1,5% for å opprettholde dybden av anestesi, med en 0,5-1 l / min oksygenstrømningshastighet.
- Plasser musen i liggende stilling på plattformen, opprettholdt ved 37 °C, og teip lemmer til elektroden.
- Fjern brysthåret med en depilatorisk krem og påfør ultralydkoblingsmiddel på musens bryst.
- Vurder tverrgående aortakonstriksjon med en 30 MHz-sonde.
- Vipp plattformen helt til venstre. Hold sonden i vertikal stilling og senk den på brystet langs høyre parasternallinje. Deretter manipulerer du X-aksen og Y-aksen under B-modus til aortabuen er tydelig synlig.
- Finn innsnevring med B-modus for å få tak i den aortabuevisningen11. Bruk farge-Doppler-modusen og pulsbølgen til å måle toppstrømningshastigheten og velg mus med en hastighet på mer enn 3000 mm/s som TAC-gruppe (verdiene er basert på foreløpige eksperimenter).
- Beregn trykkgradienten i henhold til den modifiserte versjonen av Bernoullisformel 11:
trykkgradient = 4 x Vmaks2.
MERK: Den ideelle trykkgradienten for tverrgående aortakonstriksjonsmodell varierer fra 40–80 mmHg11. - Lagre dataene og bildene ved hjelp av Cine Store og Frame Store.
- Vurder dimensjoner og kontraktilitet av venstre ventrikulær (LV) med en 30 MHz-sonde.
- Tilbakestill plattformen til horisontal posisjon. Hold sonden på 30° mot klokken i forhold til venstre parasternallinje.
- Bruk B-modus og manipulere X og Y for å få en klar og full-lang akse utsikt over hjertet.
- Trykk på M-modus for å vise indikatorlinjen. Hent bilder med Cine Store og Frame Store for senere måling av LV-kammerdimensjonen, brøkdelsforkortelse og LV-veggtykkelse.
- Når du er ferdig, stopp isofluraninnånding og la musen gjenopprette fra anestesi. Deretter returnerer dyret til buret i et 12 timers lyst / mørkt syklusrom.
- På D14 og D28 etter operasjonen, gjenta trinnene ovenfor for å måle hjerteparametrene og deretter høste hjertet for histologiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien delte vi tilfeldig 45 mus i tre grupper, sham, silke suturgruppen og den absorberbare suturgruppen (antall hver gruppe på D0 (baseline), D14 og D28 etter TAC var henholdsvis 15, 10 og 5). På D7, D14, D21 og D28 etter operasjonen ble den innsnevrede topphastigheten bestemt av ekkokardiografi. Vi fant ut at blodstrømmens hastighet ved innsnevring fortsatt var større enn 3000 mm/s i den andre uken etter TAC, selv om en absorberbar sutur hadde blitt brukt til å begrense aortabuen (Figur 1A). Videre ble trykkgradienten ved innsnevring av den absorberbare suturgruppen opprettholdt over 40 mmHg på 2 uker (figur 1B). Interessant nok var det ingen innsnevring i den fjerde uken etter operasjonen, noe som indikerer at den absorberbare suturen hadde blitt fullstendig absorbert.
Vi fant også at venstre ventrikulære bakre veggtykkelse ved end-diastole økte og venstre ventrikulær indre diameter ved enddiastole gikk litt ned på D14 etter TAC (Figur 2A-C). Det er interessant at venstre ventrikulær bakre veggtykkelse ved end-diastole i den absorberbare suturgruppen regresserte betydelig på D28 etter TAC, som ikke hadde noen signifikant forskjell fra baseline-nivået. I tillegg påvirket ikke bruken av absorberbar sutur for å gjøre modellen utkasterfraksjonen av venstre ventrikel (Figur 2D).
HW / BW-forholdet til silke suturgruppen og den absorberbare suturgruppen hadde økt med 30% sammenlignet med sham-gruppen. På D28 etter TAC regresserte myokardhypertrofi og forholdet falt tilbake til baseline-nivået (figur 3A) i den absorberbare suturgruppen, mens forholdet økte med 64% i silke suturgruppen. Resultatene av H&E-farging støttet også hjertehypertrofi (figur 3B). Til slutt var absorberbar sutur egnet til å forårsake forbigående patologisk hypertrofistimulering, som oppfylte kravene til den myokardale hypertrofiske forutsetningsmodellen.
Kvantitative data har blitt presentert som gjennomsnittlig ± SD. Sammenligninger mellom sham, silke sutur, og absorberbar sutur ble utført ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post-hoc.
Figur 1: Pulserende doppleravbildning og resultater fra maksimal hastighet og trykkgradient av innsnevring. På D0 (baseline), D7, D14, D21 og D28 etter TAC ved hjelp av silkesuging eller absorberbar sutur ble aortabue eller innsnevring målt av en pulserende bølge Doppler. (A) Representativ avbildning av topphastighet på D0 (baseline), D14 og D28 etter operasjonen i silke suturgruppen og den absorberbare suturgruppen. Blodstrømshastigheten til den absorberbare suturgruppen returnerte til baseline mens hastigheten på silke suturgruppen fortsatt var større enn 3000 mm / s på D28 etter operasjonen. (B) Trykkgradienten ble beregnet i henhold til den modifiserte Bernoullis ligning: trykkgradient = 4 x Vmaks2 (V = maksimal topphastighet). *: p < 0,05 vs sham. #: p < 0,05 vs silke suturgruppen (nummeret på hver gruppe på D0 (baseline), D14 og D28 etter TAC var henholdsvis 15, 10 og 5). Data presentert som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Venstre ventrikulære parametere for struktur og systolisk funksjon. (A) M-modus bildebehandling fra venstre ventrikel (LV) i silke sutur gruppen og absorberbar sutur gruppe på D0 (baseline), D14, og D28 etter TAC. Det representative bildet av LV-veggtykkelsen ved end-diastole var ca. 0,70 mm (D0) til 1,089 mm (D28) i silke suturgruppen. Når det gjelder den absorberbare suturgruppen, var veggtykkelsen ca. 0,658 mm (D28), som returnerte nesten til grunnlinjen. (B) Venstre ventrikulær bakre veggtykkelse ved end-diastole (LVPWd). (C) Venstre ventrikulær indre diameter ved end-diastole (LVIDd). (D) Venstre ventrikulær ejeksjonsfraksjon (EF). *: p < 0,05 vs. sham samtidig (nummeret på hver gruppe på D0 (baseline), D14 og D28 etter TAC var henholdsvis 15, 10 og 5). Data presentert som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Reversibel hjertehypertrofi i modellen for myokardhypertrofisk forutsetning. (A) Hjertevekt (HW) til kroppsvekt (BW) forhold. (B) Histologiske skiver av hjertet farget med H & E (skala bar = 50 μm). Kardiomyocytter i silke suturgruppen ble betydelig forstørret fra D14 til D28 mens størrelsen på cellene for det meste regresserte på D28 i den absorberbare suturgruppen. *: p < 0,05 vs. sham samtidig (nummeret på hver gruppe på D0 (baseline), D14 og D28 etter TAC var henholdsvis 15, 10 og 5). Data presentert som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er fortsatt et enormt underutforsket område i hjerte ikke-iskemisk forutsetning. Basert på våre tidligere studier byttet vi til å bruke absorberbare suturer for å forbedre den myokardale hypertrofiske forutsetningsmodellen.
I tidligere rapporter brukte mange etterforskere silke sutur for å begrense aortabuen8,14,15. Silke sutur var lett tilgjengelig og ble ofte brukt til kirurgisk sår sutur, vev ligation, og vev fiksering. I denne protokollen erstattet vi silke sutur med absorberbar sutur for den første TAC. Vi fant at blodstrømmens hastighet i innsnevring fortsatt nådde 3000 mm / s eller mer og varte i 2 uker, noe som var nok til å tjene som en langsiktig hypertrofisk stimulering. Deretter ville den gå tilbake til grunnlinjen på D28. Det er imidlertid vanskelig å kontrollere absorpsjonstiden for absorberbare suturer. Tiden for absorpsjon er relatert til materialet og batchen av absorberbar sutur, tilpasningsevne av vev og tetthet ved innsnevring. Vi fant tidligere at strammere innsnevring, mindre er absorpsjonstiden, men samtidig ville dødeligheten av mus øke. Derfor valgte vi topphastighet på ca. 3000 mm/s som standard, slik at absorpsjonstiden kunne kontrolleres innen 2 uker, og overlevelsesraten for mus kunne også økes. Et mer signifikant poeng var at bruk av absorberbare suturer kunne redusere bryståpningstidene til to ganger, noe som reduserte vanskeligheten i operasjonen og økte suksessen til modellen.
En respirator er vanligvis nødvendig for livsstøtte av mus under operasjonen. Det rapporteres at aortabue av mus kan begrenses uten respirator ved hjelp av suprasternal fossa tilnærming15. Dette krevde imidlertid å kutte brystbenet av mus, noe som kan forlenge den kirurgiske utvinningstiden. I denne studien valgte vi denne tilnærmingen: innsnevring av det første intercostalrommet nær brystbenet, for å utføre operasjonen. Dette var en minimalt invasiv tilnærming via lateral thoracotomy14. Overraskende nok kunne vi utføre TAC uten respirator hvis snittet var så nært som mulig for brystbenet. Denne tilnærmingen kan også effektivt unngå respiratorrelatert teknisk manipulasjon og skade12. Videre, inn i mediastinum av mus via snittet, ble aortabuen utsatt tydelig fordi det nesten ikke var noen forstyrrelse med tymisk vev og andre blodkar i det kirurgiske feltet.
Selv om det er praktisk å ikke bruke en respirator under hele operasjonen, bærer den forbedrede metoden fortsatt risikoen for pneumothorax forårsaket av pleural skade. Det er noen forslag, som kan være nyttige for å unngå å skade pleuraen. Stum spissen av nålen så mye som mulig. Etter å ha kommet inn i mediastinum, hold spissen av albuen pinsett så vertikal som mulig under hele operasjonen. Under ligasjon plasserer du avstandsstykket i mediastinum langs den fremre medianlinjen.
Oppsummert forbedret vi en musemodell av myokard hypertrofi og regresjon ved hjelp av absorberbare suturer, som kan ha mange potensielle applikasjoner i å etablere modellen for myokard hypertrofisk forutsetning, utforske mekanismen for hypertrofiregresjon, og undersøke tiden for venstre ventrikulær reversibel ombygging, og så videre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81770271; til Y, Liao), Joint Funds of the National Natural Science Foundation of China (U1908205; til Y, Liao), og Municipal Planning Projects of Scientific Technology of Guangzhou (201804020083; til Dr Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Ban, K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase gamma is a critical mediator of myocardial ischemic and adenosine-mediated preconditioning. Circulation Research. 103 (6), 643-653 (2008).
- Wu, Z. K., Iivainen, T., Pehkonen, E., Laurikka, J., Tarkka, M. R. Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization. Circulation. 106 (24), 3091-3096 (2002).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis. 204 (2), 334-341 (2009).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Lund, O., Emmertsen, K., Dorup, I., Jensen, F. T., Flo, C. Regression of left ventricular hypertrophy during 10 years after valve replacement for aortic stenosis is related to the preoperative risk profile. European Heart Journal. 24 (15), 1437-1446 (2003).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciiences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Wei, X., et al. Myocardial hypertrophic preconditioning attenuates cardiomyocyte hypertrophy and slows progression to heart failure through upregulation of S100A8/A9. Circulation. 131 (17), 1506-1517 (2015).
- Huang, J., et al. Ultrasound biomicroscopy validation of a murine model of cardiac hypertrophic preconditioning: comparison with a hemodynamic assessment. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 313 (1), 138-148 (2017).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circulation Research. 98 (6), 837-845 (2006).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101 (2016).
- Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. The European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397 (2018).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231 (2017).
