뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성
Summary
신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.
Abstract
알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 희소 돌기 부전은 일반적인 초기 병리학 적 특징이지만 특히 뇌의 회백질에서 질병 발달 및 진행에 어떻게 기여하는지는 거의 알려지지 않았습니다. 희소돌기아교세포 계통 세포의 기능 장애는 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)의 수초화 결핍 및 자가 재생 장애로 특징지어집니다. 이 두 가지 결함은 병리학의 축적을 따라 뉴런과 희소돌기아교세포 사이의 상호 작용이 중단되어 적어도 부분적으로 발생합니다. OPC는 CNS 발달 동안 수초 희소돌기아교세포를 생성합니다. 성숙한 뇌 피질에서 OPC는 주요 증식 세포 (전체 뇌 세포의 ~ 5 %를 구성)이며 신경 활동 의존적 방식으로 새로운 미엘린 형성을 제어합니다. 이러한 뉴런-희소돌기아교세포 통신은 적절한 도구의 부족으로 인해 특히 AD와 같은 신경퇴행성 상태의 맥락에서 상당히 과소 연구되고 있습니다. 최근 몇 년 동안 우리 그룹과 다른 사람들은 인간 만능 줄기 세포에서 개별적으로 기능성 뉴런과 희소돌기아교세포를 생성하기 위해 현재 사용 가능한 프로토콜을 개선하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다. 이 원고에서는 뉴런-희소돌기아교세포 연결을 모델링하기 위한 공동 배양 시스템의 구축을 포함하여 최적화된 절차에 대해 설명합니다. 우리의 예시적인 결과는 뇌 아밀로이드증 및 시냅스 무결성에 대한 OPC/희소돌기아교세포의 예상치 못한 기여를 시사하고 AD 연구를 위한 이 방법론의 유용성을 강조합니다. 이 환원 주의적 접근법은 뇌 내부의 고유 한 복잡성에서 특정 이종 세포 상호 작용을 해부하는 강력한 도구입니다. 여기에서 설명하는 프로토콜은 신경 퇴행의 발병 기전에서 희소돌기전 결함에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것으로 예상됩니다.
Introduction
희소돌기아교세포 전구세포(OPC), 수초 희소돌기아교세포 및 그 사이의 전이 유형을 포함한 희소돌기아교세포 계통 세포는 신경 발달 및 노화 전반에 걸쳐 중추신경계의 적절한 작동 및 유지를 위한 많은 중요한 기능에 적극적으로 참여하는 인간 뇌 세포1의 주요 그룹을 구성합니다.2,3,4 . 희소돌기아교세포는 백질에서 신경 활동 전달을 촉진하고 축삭 건강을 지원하기 위해 미엘린을 생성하는 것으로 잘 알려져 있지만, OPC는 수초화가 부족한 회백질에 풍부하고(~5%) 학습 행동 및 기억 형성을 제어하는 활동 의존적 신호 기능을 수행합니다. 5,6,7,8 . 알츠하이머병(AD) 및 기타 연령 관련 신경퇴행성 질환의 발병기전에서 희소돌기아세포 기능 및 기능 장애가 어떻게 연구되었는지는 연구되지 않았습니다9. 적절한 모델 시스템의 부적절 함과 실험 경로를 안내하는 일반 지식의 부족이 이러한 격차의 주요 원인입니다.
배아 줄기 (ES) 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 포함한 만능 줄기 세포로부터 인간 뇌 세포를 유도하는 최근의 돌파구에 비추어 볼 때, 현대 유전자 편집 도구와 결합 된 이러한 세포 모델은 뇌에서 세포 상호 작용의 복잡한 연결을 처리하는 강력한 도구로 등장했으며 인간 특이 적 질병 증상을 입증 할 수 있습니다10, 11. 개별 뇌 세포 유형이 동일한 AD 촉진 조건12,13에 직면하여 뚜렷하고 심지어 상충되는 효과를 나타낼 수 있다는 점을 고려할 때,이 줄기 세포 방법론은 뇌 세포 유형 모음에서 집계 판독 값만을 제공하는 확립 된 생체 내 또는 시험관 내 모델을 사용하여 이전에 놓친 세포 유형 별 정보를 고유하게 제공합니다. 지난 10년 동안 ES/iPS 세포의 트랜스분화 또는 다른 말기 분화 세포 유형(예: 섬유아세포)에서 직접 전환하여 인간 뉴런을 생성하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 많이 개발되었습니다.14,15. 특히, 주요 신경인성 전사 인자(예를 들어, 뉴로게닌 2, Ngn2)16를 인간 만능 줄기 세포에 적용하면 신경교 세포와 공배양할 필요 없이 순수 배양을 위한 잘 특성화된 뉴런 세포 유형의 균질한 집단을 생성할 수 있다12,17,18. 유도 된 인간 희소 돌기 아교 세포의 경우, 시간과 자원에서 광범위한 효율성과 수요를 가진 1 차 대응 물과 매우 유사한 기능성 세포를 생성 할 수있는 몇 가지 발표 된 프로토콜이 있습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . 현재까지 이러한 프로토콜 중 어느 것도 희소돌기아교 세포가 AD 발병 기전에 어떻게 반응하고 영향을 미치는지 조사하는 데 적용되지 않았습니다.
여기에서는 인간 유도 뉴런(iN) 및 OPC/희소돌기아교세포(iOPC/iOL)의 단일 및 혼합 배양에 대한 개선된 프로토콜을 설명합니다. 여기에 설명된 iN 프로토콜은 널리 사용되는 Ngn2 접근법(16)에 기초하며, glia-free라는 추가적인 특징을 갖는다. 결과 iN은 균질하고 특징적인 피라미드 형태, 유전자 발현 패턴 및 전기 생리 학적 특징17,18을 갖는 피질 층 2/3 흥분성 뉴런과 매우 유사합니다 (그림 1). 만능 줄기 세포의 직접 분화의 근본적인 장벽 중 일부를 극복하기 위해 우리는 저용량 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 전처리29,30의 간단하고 효과적인 방법을 개발했으며 Douvaras 및 Fossati 32의 널리 채택 된 프로토콜을 기반으로 인간 ES / iPS 세포가 iOPC 및 iOL로 트랜스 분화하는 성향이 향상되었다고보고했습니다32 . 우리는 프로토콜을 더욱 단순화하고 강력한 분화 촉진 화합물인 클레마스틴 7,33,34를 통합하여 희소돌기아교 성숙 과정을 가속화했습니다. 그 결과(그림 2), iOPC는 2주 내에 생성될 수 있고(마커 O4에 대해 ~95% 양성) 4주 내에 iOL이 생성될 수 있습니다(성숙한 마커 MBP 및 PLP1 발현). 흥미롭게도, 우리는 iOPCs만이 놀라운 양의 아밀로이드 β (Aβ)를 분비한다는 것을 발견했으며, 이는 희소 돌기 아교 세포35,36에서 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 풍부한 발현과 처리 프로테아제 β- 세크레타제 (BACE1)의 풍부한 발현을 보여주는 독립적 인 전사체 데이터와 일치합니다. 또한, 당사의 iN-iOPC 공동 배양 시스템은 MBP 양성 iOL 과정에 의한 축삭 외피를 촉진하고 시냅스 형성에 대한 상당한 지원을 제공합니다(그림 3). 따라서 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 카탈로그화된 뉴런-희소돌기아교세포 공동 배양 방법에 비해 기술적 및 생물학적 이점을 가지고 있으며 AD의 신경퇴행을 더 잘 모델링할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시냅스 구조를 안정화시키고 수초화에 의한 염분 신호 전도를 촉진하는 물리적 및 대사적 지원 외에도 희소돌기아교세포 계통 세포는 뉴런 5,6,7과의 빠르고 역동적인 혼선을 통해 뉴런 활동 패턴을 형성할 수 있습니다. AD 병리학에서 희소돌기아교세포 반응은 처음에는 염증 및 산화 스트레스에 이차적인 것으로 간주되었지만…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (R00 AG054616에서 YAH, T32 GM136566에서 KC), 스탠포드 의과 대학 및 Siebel Fellowship (SC에 수여)의 보조금으로 지원되었습니다. YAH는 브라운 중개 과학 연구소의 중개 신경 과학 센터의 GFL 번역 교수입니다.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
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