יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים
Summary
האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.
Abstract
במחלת אלצהיימר (AD) ובהפרעות נוירודגנרטיביות אחרות, כשל אוליגודנדרוגליאלי הוא תכונה פתולוגית מוקדמת נפוצה, אך האופן שבו הוא תורם להתפתחות המחלה ולהתקדמותה, במיוחד בחומר האפור של המוח, נותר ברובו לא ידוע. תפקוד לקוי של תאי שושלת אוליגודנדרוציטים מסומן על ידי ליקויים במיאלינציה והתחדשות עצמית לקויה של תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים (OPCs). שני פגמים אלה נגרמים לפחות בחלקם על ידי הפרעה של אינטראקציות בין נוירון ו oligodendrocytes לאורך הצטברות של פתולוגיה. OPCs מעוררים אוליגודנדרוציטים מיאלינים במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. בקליפת המוח הבוגרת, OPCs הם התאים המתרבים העיקריים (המהווים ~5% מכלל תאי המוח) ושולטים בהיווצרות מיאלין חדשה באופן תלוי-פעילות עצבית. תקשורת נוירון לאוליגודנדרוציטים כאלה נחקרים באופן משמעותי, במיוחד בהקשר של תנאים נוירודגנרטיביים כגון AD, בשל היעדר כלים מתאימים. בשנים האחרונות, הקבוצה שלנו ואחרים התקדמו משמעותית כדי לשפר את הפרוטוקולים הזמינים כיום כדי ליצור נוירונים פונקציונליים ואוליגודנדרוציטים בנפרד מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. בכתב יד זה, אנו מתארים את ההליכים האופטימליים שלנו, כולל הקמת מערכת תרבית משותפת כדי לדגום את הקשרים נוירון-אוליגודנדרוציטים. תוצאות ההמחשה שלנו מצביעות על תרומה בלתי צפויה של OPCs/אוליגודנדרוציטים לעמילואידוזיס במוח ולשלמות הסינפסה, ומדגישות את התועלת של מתודולוגיה זו לחקר אלצהיימר. גישה רדוקציוניסטית זו היא כלי רב עוצמה לנתח את האינטראקציות ההטרו-תאיות הספציפיות מתוך המורכבות האינהרנטית בתוך המוח. הפרוטוקולים שאנו מתארים כאן צפויים להקל על מחקרים עתידיים על פגמים אוליגודנדרוגליאליים בפתוגנזה של ניוון עצבי.
Introduction
תאי שושלת אוליגודנדרוציטים – כולל תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים (OPCs), אוליגודנדרוציטים מיאלינים וסוגי מעבר בין לבין – מהווים קבוצה מרכזית של תאי מוח אנושיים1 המשתתפים באופן פעיל בתפקודים קריטיים רבים לתפעול ותחזוקה תקינים של מערכת העצבים המרכזית שלנו במהלך ההתפתחות העצבית וההזדקנות 2,3,4 . בעוד שאוליגודנדרוציטים ידועים בייצור מיאלין כדי להקל על העברת הפעילות העצבית ולתמוך בבריאות האקסונאלית בחומר הלבן, OPCs נמצאים בשפע (~5%) בחומר אפור שבו המיאלינציה נדירה ומבצעים פונקציות איתות תלויות פעילות כדי לשלוט בהתנהגות הלמידה וביצירת הזיכרון 5,6,7,8 . כיצד תאים אוליגודנדרוגליאליים מתפקדים ותפקוד לקוי בפתוגנזה של מחלת אלצהיימר (AD) ומצבים נוירודגנרטיביים אחרים הקשורים לגיל הובנו9. הליקויים של מערכת מודל מתאימה וליקויים בידע הכללי כדי להנחות נתיב ניסויי קדימה הם הסיבות העיקריות לפער זה.
לאור פריצות הדרך האחרונות בגזירת תאי מוח אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים הכוללים תאי גזע עובריים (ES) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), מודלים תאיים כאלה בשילוב עם כלי עריכת גנים מודרניים התפתחו ככלים חזקים לטיפול בקשר המורכב של אינטראקציות תאיות במוח, והם מסוגלים להדגים ביטויי מחלה ספציפיים לאדם10, 11. בהתחשב בכך שסוגי תאי מוח בודדים יכולים להציג השפעות שונות ואף סותרות לנוכח אותם תנאים מקדמי AD12,13, מתודולוגיית תאי גזע זו מציעה באופן ייחודי מידע ספציפי לסוג התא שהוחמץ בעבר באמצעות מודלים מבוססים in vivo או in vitro המספקים רק קריאות מצטברות מאוספים של סוגי תאי מוח. בעשור האחרון פותחו מספר לא מבוטל של פרוטוקולים אמינים ליצירת תאי עצב אנושיים כתוצאה מהתמיינות טרנס-דיפרנציאציה של תאי ES/iPS או מהמרה ישירה מסוגי תאים אחרים שעברו התמיינות סופנית (למשל, פיברובלסטים)14,15. בפרט, היישום של גורמי שעתוק נוירוגניים מרכזיים (למשל, נוירוגנין 2, Ngn2)16 לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים יכול ליצור אוכלוסייה הומוגנית של סוגי תאים עצביים מאופיינים היטב עבור תרביות טהורות ללא צורך בקוקולטורה עם תאי גליה12,17,18. עבור אוליגודנדרוציטים אנושיים מושרים, ישנם כמה פרוטוקולים שפורסמו שיכולים ליצור תאים פונקציונליים הדומים מאוד לעמיתיהם הראשוניים, עם מגוון רחב של יעילות וביקוש בזמן ובמשאבים 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . עד כה, אף אחד מהפרוטוקולים הללו לא יושם כדי לחקור כיצד תאים אוליגודנדרוגליאליים מגיבים לפתוגנזה של אלצהיימר ומשפיעים עליה.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים המשופרים שלנו עבור תרביות בודדות ומעורבות של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ו-OPC/אוליגודנדרוציטים (iOPCs/iOLs). פרוטוקול iN המתואר כאן מבוסס על גישת Ngn216 הנמצאת בשימוש נרחב, ויש לו את התכונה הנוספת של היותו נטול גליה. ה-iNs המתקבלים הם הומוגניים ודומים מאוד לשכבת קליפת המוח 2/3 נוירונים מעוררים, עם מורפולוגיה פירמידלית אופיינית, דפוס ביטוי גנים ותכונות אלקטרופיזיולוגיות17,18 (איור 1). כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הבסיסיים בהתמיינות מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים, פיתחנו שיטה פשוטה ויעילה של דימתיל סולפוקסיד במינון נמוך (DMSO) לפני טיפול29,30, ודיווחנו על נטייה משופרת של תאי ES/iPS אנושיים לבצע טרנס-דיפרנציאציה ל-iOPCs ו-iOLs31, בהתבסס על פרוטוקול מותאם באופן נרחב על ידי Douvaras ו-Fossati 32 . פישטנו עוד יותר את הפרוטוקול ושילבנו תרכובת חזקה המקדמת בידול,clemastine 7,33,34, כדי להאיץ את תהליך ההבשלה האוליגודנדרוגליאלית. כתוצאה מכך (איור 2), ניתן ליצור את ה-iOPCs תוך שבועיים (~95% חיוביים עבור הסמן O4) ו-iOLs תוך ארבעה שבועות (המבטאים סמנים בוגרים MBP ו-PLP1). באופן מעניין, מצאנו ש-iOPCs לבדם מפרישים כמות יוצאת דופן של עמילואיד-β (Aβ), בהתאם לנתוני התעתיק הבלתי תלויים המראים את הביטוי השופע של חלבון מבשר העמילואיד (APP) והפרוטאז המעבד β-secretase (BACE1) בתאי שושלת אוליגודנדרוציטים35,36. יתר על כן, מערכת התרביות המשותפות iN-iOPC שלנו מקדמת את המעטפת של אקסונים על ידי תהליכי iOL חיוביים ל-MBP ומספקת תמיכה משמעותית להיווצרות סינפסות (איור 3). לפיכך, לפרוטוקולים שנפרט להלן יש יתרונות טכניים וביולוגיים על פני שיטות שיתוף פעולה של נוירונים-אוליגודנדרוגליה שקוטלגו בעבר, והם טומנים בחובם הבטחה במידול טוב יותר של הניוון העצבי באלצהיימר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנוסף לתמיכה הפיזית והמטבולית לייצוב מבני הסינפסה ולהקלה על הולכת האות המלוח על ידי מיאלינציה, תאי שושלת אוליגודנדרוציטים יכולים לעצב את דפוס הפעילות העצבית באמצעות שיחות צולבות מהירות ודינמיות עם נוירונים 5,6,7. בעוד שבפתולוגיה של AD התג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R00 AG054616 ל- Y.A.H. ו- T32 GM136566 ל- K.C.), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד ומלגת Siebel (המוענקת ל- S.C.). י.א.ה. הוא פרופסור תרגומי GFL מהמרכז למדעי המוח התרגומיים במכון בראון למדעים תרגומיים.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
