Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti
Summary
Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.
Abstract
Nella malattia di Alzheimer (AD) e in altri disturbi neurodegenerativi, l’insufficienza oligodendrogliale è una caratteristica patologica precoce comune, ma il modo in cui contribuisce allo sviluppo e alla progressione della malattia, in particolare nella materia grigia del cervello, rimane in gran parte sconosciuto. La disfunzione delle cellule della linea oligodendrocitaria è caratterizzata da carenze nella mielinizzazione e compromissione dell’auto-rinnovamento delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questi due difetti sono causati almeno in parte dall’interruzione delle interazioni tra neurone e oligodendrociti lungo l’accumulo di patologia. Gli OPC danno origine a oligodendrociti mielinizzanti durante lo sviluppo del SNC. Nella corteccia cerebrale matura, le OPC sono le principali cellule proliferative (che comprendono ~ 5% delle cellule cerebrali totali) e controllano la formazione di nuova mielina in modo dipendente dall’attività neurale. Tali comunicazioni neurone-oligodendrocita sono significativamente poco studiate, specialmente nel contesto di condizioni neurodegenerative come l’AD, a causa della mancanza di strumenti appropriati. Negli ultimi anni, il nostro gruppo e altri hanno compiuto progressi significativi per migliorare i protocolli attualmente disponibili per generare neuroni funzionali e oligodendrociti individualmente da cellule staminali pluripotenti umane. In questo manoscritto, descriviamo le nostre procedure ottimizzate, compresa la creazione di un sistema di co-coltura per modellare le connessioni neurone-oligodendrocitario. I nostri risultati illustrativi suggeriscono un contributo inaspettato da OPC / oligodendrociti all’amiloidosi cerebrale e all’integrità delle sinapsi ed evidenziano l’utilità di questa metodologia per la ricerca sull’AD. Questo approccio riduzionista è un potente strumento per sezionare le specifiche interazioni eterocellulari dalla complessità intrinseca all’interno del cervello. I protocolli che descriviamo qui dovrebbero facilitare studi futuri sui difetti oligodendrogliali nella patogenesi della neurodegenerazione.
Introduction
Le cellule della linea oligodendrocitaria, comprese le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), gli oligodendrociti mielinizzanti e i tipi di transizione intermedi, costituiscono un gruppo importante di cellule cerebrali umane1 che partecipano attivamente a molte funzioni critiche per il corretto funzionamento e mantenimento del nostro sistema nervoso centrale durante lo sviluppo neurale e l’invecchiamento 2,3,4 . Mentre gli oligodendrociti sono ben noti per la produzione di mielina per facilitare la trasmissione dell’attività neuronale e supportare la salute assonale nella sostanza bianca, le OPC sono abbondanti (~ 5%) nella materia grigia dove la mielinizzazione è scarsa e svolgono funzioni di segnalazione dipendenti dall’attività per governare il comportamento di apprendimento e la formazione della memoria 5,6,7,8 . Il modo in cui le cellule oligodendrogliali funzionano e disagiscono nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD) e di altre condizioni neurodegenerative associate all’età è stato poco studiato9. Le inadeguatezze di un sistema modello appropriato e le carenze nella conoscenza generale per guidare un percorso sperimentale in avanti sono le ragioni principali di questa lacuna.
Alla luce delle ultime scoperte nel derivare cellule cerebrali umane da cellule staminali pluripotenti, tra cui le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), tali modelli cellulari in combinazione con moderni strumenti di modifica genetica sono emersi come strumenti robusti per gestire l’intricato nesso delle interazioni cellulari nel cervello e sono in grado di dimostrare manifestazioni di malattia specifiche per l’uomo10, 11. Considerando che i singoli tipi di cellule cerebrali possono mostrare effetti distinti e persino contrastanti di fronte alle stesse condizioni che promuovono l’AD12,13, questa metodologia di cellule staminali offre in modo univoco informazioni specifiche sul tipo di cellula che in precedenza sono state perse utilizzando modelli stabiliti in vivo o in vitro che forniscono solo letture aggregate da collezioni di tipi di cellule cerebrali. Nell’ultimo decennio, un buon numero di protocolli affidabili sono stati sviluppati per generare neuroni umani dalla trans-differenziazione di cellule ES/iPS o dalla conversione diretta da altri tipi cellulari terminalmente differenziati (ad esempio, fibroblasti)14,15. In particolare, l’applicazione di fattori chiave di trascrizione neurogenica (ad esempio, neurogenina 2, Ngn2)16 a cellule staminali pluripotenti umane può generare una popolazione omogenea di tipi di cellule neuronali ben caratterizzati per colture pure senza necessità di cocoltura con cellule gliali12,17,18. Per gli oligodendrociti umani indotti, ci sono alcuni protocolli pubblicati che possono generare cellule funzionali molto simili alle loro controparti primarie, con una vasta gamma di efficienza e richiesta di tempo e risorse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ad oggi, nessuno di questi protocolli è stato applicato per studiare come le cellule oligodendrogliali rispondono e influenzano la patogenesi dell’AD.
Qui, descriviamo i nostri protocolli migliorati per colture singole e miste di neuroni indotti umani (iN) e OPC / oligodendrociti (iOPC / iOL). Il protocollo iN qui descritto si basa sull’approccio Ngn216 ampiamente utilizzato e ha la caratteristica aggiuntiva di essere privo di glia. Gli iN risultanti sono omogenei e molto simili ai neuroni eccitatori dello strato corticale 2/3, con morfologia piramidale caratteristica, pattern di espressione genica e caratteristiche elettrofisiologiche17,18 (Figura 1). Per superare alcune delle barriere fondamentali nella differenziazione diretta delle cellule staminali pluripotenti, abbiamo sviluppato un metodo semplice ed efficace di pre-trattamento a basse dosi di dimetilsolfossido (DMSO)29,30 e riportato una maggiore propensione delle cellule ES / iPS umane a transdifferenziarsi in iOPC e iOLs31, basato su un protocollo ampiamente adattato da Douvaras e Fossati 32 . Abbiamo ulteriormente semplificato il protocollo e incorporato un robusto composto che promuove la differenziazione, clemastina 7,33,34, per accelerare il processo di maturazione oligodendrogliale. Di conseguenza (Figura 2), le iOPC possono essere generate in 2 settimane (~95% positivo per il marcatore O4) e iOL in quattro settimane (esprimendo marcatori maturi MBP e PLP1). È interessante notare che abbiamo scoperto che le iOPC da sole secernono una notevole quantità di amiloide-β (Aβ), coerente con i dati trascrittomici indipendenti che mostrano l’abbondante espressione della proteina precursore dell’amiloide (APP) e della proteasi di trasformazione β-secretasi (BACE1) nelle cellule del lignaggio oligodendrocitario35,36. Inoltre, il nostro sistema di co-coltura iN-iOPC promuove l’inguaina degli assoni mediante processi iOL MBP-positivi e fornisce un supporto significativo per la formazione delle sinapsi (Figura 3). Pertanto, i protocolli che abbiamo dettagliato di seguito hanno vantaggi tecnici e biologici rispetto ai metodi di co-coltura neurone-oligodendroglia precedentemente catalogati e promettono di modellare meglio la neurodegenerazione nell’AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oltre al supporto fisico e metabolico per stabilizzare le strutture sinaptiche e facilitare la conduzione del segnale saltatorio da parte della mielinizzazione, le cellule del lignaggio oligodendrocitario possono modellare il modello di attività neuronale attraverso cross-talk rapidi e dinamici con i neuroni 5,6,7. Mentre nella patologia di AD le risposte oligodendrogliali erano inizialmente considerate semplicemente secondarie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (R00 AG054616 a Y.A.H. e T32 GM136566 a K.C.), dalla Stanford University School of Medicine e da una Siebel Fellowship (assegnata a S.C.). Y.A.H. è un professore traslazionale GFL presso il Center for Translational Neuroscience del Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
