توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن
Summary
التفاعلات العصبية الدبقية في التنكس العصبي ليست مفهومة جيدا بسبب عدم كفاية الأدوات والأساليب. هنا ، نصف البروتوكولات المثلى للحصول على الخلايا العصبية المستحثة ، وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ونقدم أمثلة على قيم هذه الطرق في فهم المساهمات الخاصة بنوع الخلية في مرض الزهايمر.
Abstract
في مرض الزهايمر (AD) والاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى ، يعد الفشل الدبقي قليل التغصن سمة مرضية مبكرة شائعة ، ولكن كيف يساهم في تطور المرض وتطوره ، خاصة في المادة الرمادية للدماغ ، لا يزال غير معروف إلى حد كبير. يتميز الخلل الوظيفي لخلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن بأوجه القصور في الميالين وضعف التجديد الذاتي لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs). يحدث هذان العيبان جزئيا على الأقل بسبب اضطراب التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن على طول تراكم علم الأمراض. تؤدي OPCs إلى ظهور الخلايا قليلة التغصن الميالينية أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي. في قشرة الدماغ الناضجة ، OPCs هي الخلايا التكاثرية الرئيسية (التي تضم ~ 5 ٪ من إجمالي خلايا الدماغ) وتتحكم في تكوين المايلين الجديد بطريقة تعتمد على النشاط العصبي. لم تتم دراسة مثل هذه الاتصالات من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية قليلة التغصن بشكل كبير ، خاصة في سياق الحالات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ، بسبب نقص الأدوات المناسبة. في السنوات الأخيرة ، أحرزت مجموعتنا وغيرها تقدما كبيرا لتحسين البروتوكولات المتاحة حاليا لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية والخلايا قليلة التغصن بشكل فردي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. في هذه المخطوطة ، نصف إجراءاتنا المحسنة ، بما في ذلك إنشاء نظام زراعة مشتركة لنمذجة اتصالات الخلايا العصبية قليلة التغصن. تشير نتائجنا التوضيحية إلى مساهمة غير متوقعة من OPCs / oligodendrocytes في الداء النشواني في الدماغ وسلامة المشبك العصبي وتسليط الضوء على فائدة هذه المنهجية لأبحاث مرض الزهايمر. هذا النهج الاختزالي هو أداة قوية لتشريح التفاعلات الخلوية غير المتجانسة المحددة من التعقيد المتأصل داخل الدماغ. من المتوقع أن تسهل البروتوكولات التي نصفها هنا الدراسات المستقبلية حول عيوب قلة التغصن في التسبب في التنكس العصبي.
Introduction
تشكل خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن – بما في ذلك خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) ، والخلايا قليلة التغصن الميالينية ، والأنواع الانتقالية بينهما – مجموعة رئيسية من خلايا الدماغ البشرية1 التي تشارك بنشاط في العديد من الوظائف الحيوية من أجل التشغيل السليم وصيانة نظامنا العصبي المركزي طوال التطور العصبي والشيخوخة2،3،4 . في حين أن oligodendrocytes معروفة جيدا بإنتاج المايلين لتسهيل انتقال النشاط العصبي ودعم الصحة المحورية في المادة البيضاء ، فإن OPCs وفيرة (~ 5٪) في المادة الرمادية حيث يكون الميالين نادرا وتؤدي وظائف إشارات تعتمد على النشاط للتحكم في سلوك التعلم وتكوين الذاكرة5،6،7،8 . كيف تعمل الخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلل الوظيفي في التسبب في مرض الزهايمر (AD) وغيرها من الحالات التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر لم تتم دراستها9. وتتمثل أوجه القصور في نظام نموذجي مناسب وأوجه القصور في المعارف العامة لتوجيه مسار تجريبي إلى الأمام في الأسباب الرئيسية لهذه الفجوة.
في ضوء أحدث الاختراقات في اشتقاق خلايا الدماغ البشري من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، ظهرت هذه النماذج الخلوية جنبا إلى جنب مع أدوات تحرير الجينات الحديثة كأدوات قوية للتعامل مع العلاقة المعقدة للتفاعلات الخلوية في الدماغ ، وهي قادرة على إظهار مظاهر المرض الخاصة بالإنسان10 ، 11. بالنظر إلى أن أنواع خلايا الدماغ الفردية يمكن أن تظهر تأثيرات مميزة وحتى متضاربة في مواجهة نفس الظروف المعززة لمرض الزهايمر12,13 ، فإن منهجية الخلايا الجذعية هذه تقدم بشكل فريد معلومات خاصة بنوع الخلية تم تفويتها سابقا باستخدام نماذج ثابتة في الجسم الحي أو في المختبر توفر فقط قراءات مجمعة من مجموعات من أنواع خلايا الدماغ. في العقد الماضي ، تم تطوير عدد كبير من البروتوكولات الموثوقة لتوليد الخلايا العصبية البشرية من التمايز العابر للخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو التحويل المباشر من أنواع الخلايا الأخرى المتمايزة نهائيا (مثل الخلايا الليفية)14,15. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي تطبيق عوامل النسخ العصبية الرئيسية (على سبيل المثال ، neurogenin 2 ، Ngn2)16 على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى توليد مجموعة متجانسة من أنواع الخلايا العصبية المميزة جيدا للمزارع النقية دون الحاجة إلى التثاقف مع الخلايا الدبقية12،17،18. بالنسبة للخلايا قليلة التغصن البشرية المستحثة ، هناك عدد قليل من البروتوكولات المنشورة التي يمكن أن تولد خلايا وظيفية تشبه إلى حد كبير نظيراتها الأولية ، مع مجموعة واسعة من الكفاءة والطلب في الوقت والموارد19،20،21،22،23،24،25،26،27،28 . حتى الآن ، لم يتم تطبيق أي من هذه البروتوكولات للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا قليلة التغصن وتأثيرها على التسبب في مرض الزهايمر.
هنا ، نصف بروتوكولاتنا المحسنة للثقافات الفردية والمختلطة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) و OPCs / oligodendrocytes (iOPCs / iOLs). يعتمد بروتوكول iN الموصوف هنا على نهج Ngn216 المستخدم على نطاق واسع ، وله ميزة إضافية تتمثل في كونه خاليا من الدبقية. تكون iNs الناتجة متجانسة وتشبه إلى حد كبير الخلايا العصبية المثيرة للطبقة القشرية 2/3 ، مع مورفولوجيا هرمية مميزة ونمط التعبير الجيني وميزات فيزيولوجية كهربية17,18 (الشكل 1). للتغلب على بعض الحواجز الأساسية في التمايز الموجه للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة للمعالجة المسبقة لجرعة منخفضة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)29،30 ، وأبلغنا عن ميل معزز لخلايا ES / iPS البشرية للانتقال إلى iOPCs و iOLs31 ، بناء على بروتوكول تم تكييفه على نطاق واسع بواسطة Douvaras و Fossati 32 . لقد قمنا بتبسيط البروتوكول بشكل أكبر ودمجنا مركبا قويا يعزز التمايز ، كليماستين7،33،34 ، لتسريع عملية النضج الدبقي قليل التغصن. نتيجة لذلك (الشكل 2) ، يمكن إنشاء iOPCs في أسبوعين (~ 95٪ إيجابي للعلامة O4) و iOLs في أربعة أسابيع (معبرا عن علامات ناضجة MBP و PLP1). ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن iOPCs وحدها تفرز كمية ملحوظة من β الأميلويد (Aβ) ، بما يتفق مع البيانات النسخية المستقلة التي تظهر التعبير الوفير لبروتين السلائف الأميلويد (APP) ومعالجة البروتياز β-secretase (BACE1) في خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن35,36. علاوة على ذلك ، يعزز نظام الاستزراع المشترك iN-iOPC الخاص بنا تغليف المحاور من خلال عمليات iOL الإيجابية MBP ويوفر دعما كبيرا لتشكيل المشبك العصبي (الشكل 3). وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي قمنا بتفصيلها أدناه لها مزايا تقنية وبيولوجية على طرق الاستزراع المشترك للخلايا العصبية قليلة التغصن المفهرسة سابقا ، وتبشر بنمذجة أفضل للتنكس العصبي في مرض الزهايمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالإضافة إلى الدعم الجسدي والأيضي لتحقيق الاستقرار في هياكل المشبك وتسهيل توصيل الإشارة الملحية عن طريق الميالين ، يمكن لخلايا سلالة oligodendrocyte تشكيل نمط النشاط العصبي عبر محادثات متقاطعة سريعة وديناميكية مع الخلايا العصبية5،6،7. بينما في…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R00 AG054616 إلى YAH و T32 GM136566 إلى KC) ، وكلية الطب بجامعة ستانفورد وزمالة Siebel (الممنوحة ل SC). Y.A.H. هو أستاذ متعدية في GFL من مركز علم الأعصاب الانتقالي في معهد براون للعلوم الانتقالية.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
