JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Генерация нейронов человека и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток для моделирования нейронно-олигодендроцитарных взаимодействий

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61778
, , , , , , ,
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry,Brown University, 2Department of Neurology,The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine,Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology,Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science,Brown University

Summary

Нейронно-глиальные взаимодействия при нейродегенерации недостаточно изучены из-за неадекватных инструментов и методов. Здесь мы описываем оптимизированные протоколы для получения индуцированных нейронов, клеток-предшественников олигодендроцитов и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека и приводим примеры значений этих методов в понимании специфических для типа клеток вклада в болезнь Альцгеймера.

Abstract

При болезни Альцгеймера (БА) и других нейродегенеративных расстройствах олигодендроглиальная недостаточность является общей ранней патологической особенностью, но как она способствует развитию и прогрессированию заболевания, особенно в сером веществе мозга, остается в значительной степени неизвестным. Дисфункция клеток линии олигодендроцитов характеризуется недостатками миелинизации и нарушением самообновления клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК). Эти два дефекта вызваны, по крайней мере частично, нарушением взаимодействия между нейронами и олигодендроцитами вдоль накопления патологии. ОПК дают начало миелинизации олигодендроцитов во время развития ЦНС. В зрелой коре головного мозга OPC являются основными пролиферативными клетками (составляющими ~ 5% от общего количества клеток мозга) и контролируют образование новых миелинов в зависимости от нейронной активности. Такие нейронно-олигодендроцитарные коммуникации значительно недоизучены, особенно в контексте нейродегенеративных состояний, таких как БА, из-за отсутствия соответствующих инструментов. В последние годы наша группа и другие добились значительного прогресса в улучшении доступных в настоящее время протоколов для генерации функциональных нейронов и олигодендроцитов индивидуально из плюрипотентных стволовых клеток человека. В этой рукописи мы описываем наши оптимизированные процедуры, включая создание системы кокультуры для моделирования нейронно-олигодендроцитарных связей. Наши иллюстративные результаты свидетельствуют о неожиданном вкладе OPCs / олигодендроцитов в амилоидоз мозга и целостность синапсов и подчеркивают полезность этой методологии для исследований БА. Этот редукционистский подход является мощным инструментом для препарирования специфических гетероклеточных взаимодействий из присущей сложности внутри мозга. Ожидается, что протоколы, которые мы описываем здесь, облегчат будущие исследования олигодендроглиальных дефектов в патогенезе нейродегенерации.

Introduction

Клетки линии олигодендроцитов, включая клетки-предшественники олигодендроцитов (OPCs), миелинирующие олигодендроциты и переходные типы между ними, составляют основную группу клеток головного мозга человека1, которые активно участвуют во многих критических функциях для правильной работы и поддержания нашей центральной нервной системы на протяжении всего нервного развития и старения 2,3,4 . В то время как олигодендроциты хорошо известны тем, что производят миелин для облегчения передачи активности нейронов и поддержки здоровья аксонов в белом веществе, OPC в изобилии (~ 5%) в сером веществе, где миелинизация скудна, и выполняют зависящие от активности сигнальные функции для управления поведением обучения и формированием памяти 5,6,7,8 . Как функционируют олигодендроглиальные клетки и дисфункция в патогенезе болезни Альцгеймера (БА) и других возрастных нейродегенеративных состояний, было недостаточно изучено9. Недостатки соответствующей модельной системы и недостатки в общих знаниях, позволяющих направлять экспериментальный путь вперед, являются основными причинами этого разрыва.

В свете последних прорывов в получении клеток человеческого мозга из плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые (ES) и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, такие клеточные модели в сочетании с современными инструментами редактирования генов стали надежными инструментами для обработки сложной связи клеточных взаимодействий в мозге и способны демонстрировать специфические для человека проявления заболеваний10, 11. Учитывая, что отдельные типы клеток мозга могут проявлять различные и даже противоречивые эффекты перед лицом одних и тех же условий, способствующих АД12,13, эта методология стволовых клеток однозначно предлагает информацию, специфичную для типа клеток, которая ранее была пропущена с использованием установленных моделей in vivo или in vitro, которые обеспечивают только агрегированные показания из коллекций типов клеток мозга. В последнее десятилетие было разработано большое количество надежных протоколов для генерации нейронов человека из трансдифференцировки ES/iPS-клеток или прямого преобразования из других терминально дифференцированных типов клеток (например, фибробластов)14,15. В частности, применение ключевых нейрогенных факторов транскрипции (например, нейрогенина 2, Ngn2)16 к плюрипотентным стволовым клеткам человека может генерировать однородную популяцию хорошо охарактеризованных типов нейрональных клеток для чистых культур без необходимости кокультурирования с глиальными клетками 12,17,18. Для индуцированных человеческих олигодендроцитов существует несколько опубликованных протоколов, которые могут генерировать функциональные клетки, очень похожие на их первичные аналоги, с широким диапазоном эффективности и спроса во времени и ресурсах 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . На сегодняшний день ни один из этих протоколов не был применен для исследования того, как олигодендроглиальные клетки реагируют и влияют на патогенез БА.

Здесь мы описываем наши улучшенные протоколы для одиночных и смешанных культур индуцированных человеком нейронов (iNs) и OPCs / олигодендроцитов (iOPCs / iOL). Протокол iN, описанный здесь, основан на широко используемом подходеNgn2 16 и имеет дополнительную особенность быть свободным от глии. Полученные iNs однородны и очень напоминают кортикальный слой 2/3 возбуждающих нейронов, с характерной пирамидальной морфологией, паттерном экспрессии генов и электрофизиологическими особенностями17,18 (Рисунок 1). Чтобы преодолеть некоторые из фундаментальных барьеров в направленной дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток, мы разработали простой и эффективный метод предварительного лечения низкими дозами диметилсульфоксида (DMSO)29,30 и сообщили о повышенной склонности человеческих ES/iPS-клеток к трансдифференциации в iOPCs и iOL31, основанный на широко адаптированном протоколе Douvaras и Fossati32. . Мы еще больше упростили протокол и включили надежное соединение, способствующее дифференцировке, клемастин 7,33,34, для ускорения процесса созревания олигодендроглии. В результате (рисунок 2) iOPC могут быть сгенерированы за 2 недели (~95% положительных для маркера O4) и iOL за четыре недели (экспрессируя зрелые маркеры MBP и PLP1). Интересно, что мы обнаружили, что только iOPCs секретируют значительное количество β амилоида (Aβ), что согласуется с независимыми транскриптомными данными, показывающими обильную экспрессию белка-предшественника амилоида (APP) и обработку протеазы β-секретазы (BACE1) в клетках линии олигодендроцитов35,36. Кроме того, наша система кокультуры iN-iOPC способствует оболваниванию аксонов MBP-положительными процессами iOL и обеспечивает значительную поддержку образования синапсов (рисунок 3). Таким образом, протоколы, которые мы подробно описали ниже, имеют технические и биологические преимущества по сравнению с ранее каталогизированными методами совместного культивирования нейронов и олигодендроглии и имеют перспективу в лучшем моделировании нейродегенерации при БА.

Protocol

1. Индукция нейронов человека из плюрипотентных стволовых клеток человека Препарат лентивируса (~5 дней, подробный протокол, как описано ранее16)Пластина ~ 1 миллион HEK293T клеток в каждой колбе T75, чтобы иметь их ~ 40% слива при выполнении трансфекции. Трансфектируйте их …

Representative Results

Прямая генерация индуцированных человеком нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клетокОчень важно, чтобы исходные плюрипотентные стволовые клетки человека проявляли высокую степень плюрипотентности для успешной генерации iNs или iOPCs / iOL. Поэтому клетки должны…

Discussion

В дополнение к физической и метаболической поддержке для стабилизации синапсных структур и облегчения проведения соляного сигнала путем миелинизации, клетки линии олигодендроцитов могут формировать паттерн активности нейронов посредством быстрых и динамических перекрестных разго…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R00 AG054616 для Y.A.H. и T32 GM136566 для K.C.), Медицинской школы Стэнфордского университета и стипендии Siebel (присуждается S.C.). Y.A.H. является профессором трансляции GFL из Центра трансляционной неврологии в Институте трансляционных наук Брауна.

Materials

Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
  2. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  3. De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
  4. Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  5. Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
  6. Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
  7. Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
  8. Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
  9. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  10. Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
  11. Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
  12. Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
  13. TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
  14. Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
  15. Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  17. Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
  18. Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
  19. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
  20. Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
  21. Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
  22. Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
  23. Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
  24. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
  25. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
  26. Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
  27. Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
  28. Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
  29. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  30. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
  31. Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
  32. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  33. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
  34. Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
  35. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  36. Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
  37. Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
  38. Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
  39. Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
  40. Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
  41. Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
  42. Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).

Tags

Pluripotent Stem CellsNeuronOligodendrocyteNeurodegenerative DiseaseAlzheimer’s DiseaseNeuron-oligodendrocyte InteractionsHEK293T CellsNGN2Tetracycline TransactivatorLentivirusDoxycyclinePuromycinDMEM/F-12N2 Supplement
check_url/61778?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O’Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image