Generering af humane neuroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller til modellering af neuron-oligodendrocytinteraktioner
Summary
Neuron-glial-interaktionerne i neurodegeneration forstås ikke godt på grund af utilstrækkelige værktøjer og metoder. Her beskriver vi optimerede protokoller til opnåelse af inducerede neuroner, oligodendrocytprecursorceller og oligodendrocytter fra humane pluripotente stamceller og giver eksempler på værdierne af disse metoder til forståelse af celletypespecifikke bidrag i Alzheimers sygdom.
Abstract
I Alzheimers sygdom (AD) og andre neurodegenerative lidelser er oligodendroglial svigt et almindeligt tidligt patologisk træk, men hvordan det bidrager til sygdomsudvikling og progression, især i hjernens grå stof, forbliver stort set ukendt. Dysfunktionen af oligodendrocyt-afstamningsceller er kendetegnet ved mangler i myelinering og nedsat selvfornyelse af oligodendrocytprecursorceller (OPC’er). Disse to defekter er forårsaget i det mindste delvist af forstyrrelsen af interaktioner mellem neuron og oligodendrocytter langs opbygningen af patologi. OPC’er giver anledning til myeliniserende oligodendrocytter under CNS-udvikling. I den modne hjernebark er OPC’er de vigtigste proliferative celler (bestående af ~ 5% af de samlede hjerneceller) og styrer ny myelindannelse på en neural aktivitetsafhængig måde. Sådan neuron-til-oligodendrocytkommunikation er signifikant undervurderet, især i forbindelse med neurodegenerative tilstande som AD, på grund af manglen på passende værktøjer. I de senere år har vores gruppe og andre gjort betydelige fremskridt for at forbedre de nuværende tilgængelige protokoller til at generere funktionelle neuroner og oligodendrocytter individuelt fra humane pluripotente stamceller. I dette manuskript beskriver vi vores optimerede procedurer, herunder etableringen af et co-kultursystem til at modellere neuron-oligodendrocytforbindelserne. Vores illustrative resultater tyder på et uventet bidrag fra OPC’er / oligodendrocytter til hjernens amyloidose og synapse integritet og fremhæver nytten af denne metode til AD-forskning. Denne reduktionistiske tilgang er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de specifikke heterocellulære interaktioner ud af den iboende kompleksitet inde i hjernen. De protokoller, vi beskriver her, forventes at lette fremtidige undersøgelser af oligodendrogliale defekter i patogenesen af neurodegeneration.
Introduction
Oligodendrocyt-afstamningsceller – herunder oligodendrocytprecursorceller (OPC’er), myeliniserende oligodendrocytter og overgangstyper derimellem – udgør en hovedgruppe af humane hjerneceller1, der aktivt deltager i mange kritiske funktioner for korrekt drift og vedligeholdelse af vores centralnervesystem gennem neural udvikling og aldring 2,3,4 . Mens oligodendrocytter er velkendte for at producere myelin for at lette neuronal aktivitetsoverførsel og understøtte aksonal sundhed i hvidt stof, er OPC’er rigelige (~ 5%) i gråt stof, hvor myelinering er knap og udfører aktivitetsafhængige signalfunktioner til at styre læringsadfærd og hukommelsesdannelse 5,6,7,8 . Hvordan oligodendrogliale celler fungerer og dysfunktion i patogenesen af Alzheimers sygdom (AD) og andre aldersassocierede neurodegenerative tilstande er blevet undervurderet9. Utilstrækkeligheden af et passende modelsystem og mangler i den generelle viden til at styre en eksperimentel vej fremad er hovedårsagerne til denne kløft.
I lyset af de seneste gennembrud inden for udlede humane hjerneceller fra pluripotente stamceller, herunder embryonale stamceller (ES) og inducerede pluripotente stamceller (iPS), er sådanne cellulære modeller i forbindelse med moderne genredigeringsværktøjer opstået som robuste værktøjer til at håndtere den indviklede sammenhæng mellem cellulære interaktioner i hjernen og er i stand til at demonstrere humanspecifikke sygdomsmanifestationer10, 11. I betragtning af at individuelle hjernecelletyper kan udvise forskellige og endda modstridende virkninger i lyset af de samme AD-fremmende forhold12,13, tilbyder denne stamcellemetode unikt celletypespecifik information, der tidligere er blevet savnet ved hjælp af etablerede in vivo- eller in vitro-modeller, der kun giver aggregerede aflæsninger fra samlinger af hjernecelletyper. I det sidste årti er der udviklet et stort antal pålidelige protokoller til at generere humane neuroner fra transdifferentiering af ES / iPS-celler eller direkte konvertering fra andre terminalt differentierede celletyper (f.eks. Fibroblaster)14,15. Især kan anvendelsen af centrale neurogene transkriptionsfaktorer (f.eks. Neurogenin 2, Ngn2)16 på humane pluripotente stamceller generere en homogen population af velkarakteriserede neuronale celletyper til rene kulturer uden behov for cokulturering med gliaceller12,17,18. For inducerede humane oligodendrocytter er der et par offentliggjorte protokoller, der kan generere funktionelle celler, der ligner deres primære modstykker, med en bred vifte af effektivitet og efterspørgsel i tid og ressourcer 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Til dato er ingen af disse protokoller blevet anvendt til at undersøge, hvordan oligodendrogliale celler reagerer på og påvirker AD-patogenese.
Her beskriver vi vores forbedrede protokoller for enkelt- og blandede kulturer af humaninducerede neuroner (iN’er) og OPC’er / oligodendrocytter (iOPC’er / iOL’er). Den her beskrevne iN-protokol er baseret på den meget anvendte Ngn2-tilgang16 og har den ekstra funktion at være gliafri. De resulterende iN’er er homogene og ligner meget det kortikale lag 2/3 excitatoriske neuroner med karakteristisk pyramidemorfologi, genekspressionsmønster og elektrofysiologiske træk17,18 (figur 1). For at overvinde nogle af de grundlæggende barrierer i rettet differentiering af pluripotente stamceller har vi udviklet en enkel og effektiv metode til lavdosis dimethylsulfoxid (DMSO) forbehandling29,30 og rapporteret en forbedret tilbøjelighed hos humane ES/iPS-celler til at transdifferentiere til iOPC’er og iOL’er31, baseret på en bredt tilpasset protokol af Douvaras og Fossati 32 . Vi har yderligere forenklet protokollen og indarbejdet en robust differentieringsfremmende forbindelse, clemastin 7,33,34, for at fremskynde processen med oligodendroglial modning. Som et resultat (figur 2) kan iOPC’erne genereres på 2 uger (~ 95% positive for markøren O4) og iOL’erne på fire uger (udtrykker modne markører MBP og PLP1). Interessant nok fandt vi, at iOPC’er alene udskiller en bemærkelsesværdig mængde amyloid-β (Aβ), i overensstemmelse med de uafhængige transkriptomiske data, der viser den rigelige ekspression af amyloidprecursorproteinet (APP) og behandlingsprotease β-sekretase (BACE1) i oligodendrocyt-afstamningsceller35,36. Desuden fremmer vores iN-iOPC-samkultursystem ensheathing af axoner ved MBP-positive iOL-processer og giver betydelig støtte til synapsedannelse (figur 3). Således har de protokoller, vi har beskrevet nedenfor, tekniske og biologiske fordele i forhold til tidligere katalogiserede neuron-oligodendroglia co-dyrkningsmetoder og har et løfte om bedre modellering af neurodegenerationen i AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ud over den fysiske og metaboliske støtte til at stabilisere synapsestrukturerne og lette saltsignalledningen ved myelinering, kan oligodendrocytlinjeceller forme neuronalt aktivitetsmønster via hurtige og dynamiske krydssamtaler med neuroner 5,6,7. Mens oligodendroglial-reaktionerne i AD-patologi oprindeligt blev betragtet som blot sekundære i forhold til inflammation og oxidative belastninger, er der nu lovende beviser, der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R00 AG054616 til Y.A.H. og T32 GM136566 til K.C.), Stanford University School of Medicine og et Siebel Fellowship (tildelt SC). Y.A.H. er en GFL Translational Professor fra Center for Translational Neuroscience i Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
