मॉडलिंग न्यूरॉन-ओलिगोडेंड्रोसाइट इंटरैक्शन के लिए प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से मानव न्यूरॉन्स और ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की पीढ़ी
Summary
अपर्याप्त उपकरणों और विधियों के कारण न्यूरोडीजेनेरेशन में न्यूरॉन-ग्लियल इंटरैक्शन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। यहां, हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्रेरित न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स प्राप्त करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और अल्जाइमर रोग में सेल-प्रकार-विशिष्ट योगदान को समझने में इन तरीकों के मूल्यों के उदाहरण प्रदान करते हैं।
Abstract
अल्जाइमर रोग (एडी) और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में, ऑलिगोडेंड्रोग्लियल विफलता एक आम प्रारंभिक रोग संबंधी विशेषता है, लेकिन यह रोग के विकास और प्रगति में कैसे योगदान देता है, विशेष रूप से मस्तिष्क के ग्रे पदार्थ में, काफी हद तक अज्ञात है। ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंश कोशिकाओं की शिथिलता को माइलिनेशन में कमी और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) के बिगड़ा हुआ आत्म-नवीकरण द्वारा चिह्नित किया जाता है। ये दो दोष कम से कम पैथोलॉजी के निर्माण के साथ न्यूरॉन और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के बीच बातचीत के व्यवधान के कारण होते हैं। ओपीसी सीएनएस विकास के दौरान माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स को जन्म देते हैं। परिपक्व मस्तिष्क प्रांतस्था में, ओपीसी प्रमुख प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं हैं (जिसमें कुल मस्तिष्क कोशिकाओं का ~ 5% शामिल है) और तंत्रिका गतिविधि-निर्भर तरीके से नए माइलिन गठन को नियंत्रित करते हैं। इस तरह के न्यूरॉन-टू-ऑलिगोडेंड्रोसाइट संचार का काफी कम अध्ययन किया जाता है, विशेष रूप से एडी जैसी न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के संदर्भ में, उचित उपकरणों की कमी के कारण। हाल के वर्षों में, हमारे समूह और अन्य लोगों ने मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से व्यक्तिगत रूप से कार्यात्मक न्यूरॉन्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की है। इस पांडुलिपि में, हम अपनी अनुकूलित प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, जिसमें न्यूरॉन-ऑलिगोडेंड्रोसाइट कनेक्शन को मॉडल करने के लिए एक सह-संस्कृति प्रणाली की स्थापना शामिल है। ओलिगोडेंड्रोसाइट्स से मस्तिष्क एमाइलॉयडोसिस और सिनैप्स अखंडता में एक अप्रत्याशित योगदान का सुझाव देते हैं और एडी अनुसंधान के लिए इस पद्धति की उपयोगिता को उजागर करते हैं। यह न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण मस्तिष्क के अंदर अंतर्निहित जटिलता से विशिष्ट हेटरो-सेलुलर इंटरैक्शन को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां हम जिन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वे न्यूरोडीजेनेरेशन के रोगजनन में ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल दोषों पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा प्रदान करने की उम्मीद करते हैं।
Introduction
ओलिगोडेंड्रोसाइट वंश कोशिकाएं – जिसमें ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं (ओपीसी), माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और बीच में संक्रमणकालीन प्रकार शामिल हैं – मानव मस्तिष्क कोशिकाओं के एक प्रमुख समूह का गठन करते हैं1 जो तंत्रिका विकास और उम्र बढ़ने के दौरान हमारे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उचित संचालन और रखरखाव के लिए कई महत्वपूर्ण कार्यों में सक्रिय रूप से भाग लेते हैं। . जबकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स न्यूरोनल गतिविधि संचरण की सुविधा और सफेद पदार्थ में अक्षीय स्वास्थ्य का समर्थन करने के लिए माइलिन के उत्पादन के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, ओपीसी ग्रे पदार्थ में प्रचुर मात्रा में (~ 5%) होते हैं जहां माइलिनेशन दुर्लभ होता है और सीखने के व्यवहार और स्मृति गठन को नियंत्रित करने के लिए गतिविधि-निर्भर सिग्नलिंग कार्य करता है 5,6,7,8 . अल्जाइमर रोग (एडी) और अन्य उम्र से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के रोगजनन में ऑलिगोडेंड्रोग्लियल कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं और शिथिलता काअध्ययन किया गया है। एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली की अपर्याप्तता और एक प्रयोगात्मक पथ को आगे बढ़ाने के लिए सामान्य ज्ञान में कमियां इस अंतर के प्रमुख कारण हैं।
भ्रूण स्टेम (ईएस) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं सहित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव मस्तिष्क कोशिकाओं को प्राप्त करने में नवीनतम सफलताओं के प्रकाश में, आधुनिक जीन संपादन उपकरणों के साथ संयोजन में ऐसे सेलुलर मॉडल मस्तिष्क में सेलुलर इंटरैक्शन के जटिल गठजोड़ को संभालने के लिए मजबूत उपकरण के रूप में उभरे हैं, और मानव-विशिष्ट रोग अभिव्यक्तियों का प्रदर्शन करने में सक्षम हैं। 11. यह देखते हुए कि व्यक्तिगत मस्तिष्क सेल प्रकार एक ही एडी-बढ़ावा देने वाली स्थितियों12,13 के सामने अलग-अलग और यहां तक कि परस्पर विरोधी प्रभाव प्रदर्शित कर सकते हैं, यह स्टेम सेल पद्धति विशिष्ट रूप से सेल प्रकार-विशिष्ट जानकारी प्रदान करती है जो पहले विवो या इन विट्रो मॉडल में स्थापित का उपयोग करके याद की गई है जो केवल मस्तिष्क सेल प्रकारों के संग्रह से कुल रीडआउट प्रदान करते हैं। पिछले दशक में, ईएस / आईपीएस कोशिकाओं के ट्रांस-भेदभाव से मानव न्यूरॉन्स उत्पन्न करने या अन्य टर्मिनल रूप से विभेदित सेल प्रकारों (जैसे, फाइब्रोब्लास्ट) 14,15 से प्रत्यक्ष रूपांतरण से मानव न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए अच्छी संख्या में विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। विशेष रूप से, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रमुख न्यूरोजेनिक प्रतिलेखन कारकों (जैसे, न्यूरोजेनिन 2, एनजीएन 2) 16 का अनुप्रयोग ग्लियाल कोशिकाओं12,17,18 के साथ सह-संवर्धन की आवश्यकता के बिना शुद्ध संस्कृतियों के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाले न्यूरोनल सेल प्रकारों की एक सजातीय आबादी उत्पन्न कर सकता है। प्रेरित मानव ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए, कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं जो अपने प्राथमिक समकक्षों के समान कार्यात्मक कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, समय और संसाधनों में दक्षता और मांग की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . आज तक, इनमें से कोई भी प्रोटोकॉल यह जांचने के लिए लागू नहीं किया गया है कि ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल कोशिकाएं एडी रोगजनन का जवाब कैसे देती हैं और प्रभावित करती हैं।
यहां, हम मानव प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएन) और ओपीसी / ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (आईओपीसी / आईओएल) की एकल और मिश्रित संस्कृतियों के लिए हमारे बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित आईएन प्रोटोकॉल व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एनजीएन 2 दृष्टिकोण16 पर आधारित है, और इसमें ग्लिया-मुक्त होने की अतिरिक्त विशेषता है। परिणामी आईएन समरूप होते हैं और कॉर्टिकल परत 2/3 उत्तेजक न्यूरॉन्स से मिलते-जुलते हैं, जिसमें विशिष्ट पिरामिड आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताएं17,18 (चित्रा 1) हैं। प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के निर्देशित विभेदन में कुछ मूलभूत बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने कम खुराक वाले डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) पूर्व-उपचार29,30 की एक सरल और प्रभावी विधि विकसित की है, और मानव ईएस / आईपीएस कोशिकाओं की आईओपीसी और आईओएल 31 में अंतर करने की बढ़ी हुई प्रवृत्ति की सूचना दी है, जो डौवारस और फोसाती32 द्वारा व्यापक रूप से अनुकूलित प्रोटोकॉल पर आधारित है। . हमने प्रोटोकॉल को और सरल बनाया है और ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल परिपक्वता की प्रक्रिया को तेज करने के लिए एक मजबूत भेदभाव को बढ़ावा देने वाले यौगिक, क्लेमास्टीन 7,33,34 को शामिल किया है। नतीजतन (चित्रा 2), आईओपीसी 2 सप्ताह में उत्पन्न हो सकते हैं (मार्कर ओ 4 के लिए ~ 95% सकारात्मक) और चार सप्ताह में आईओएल (परिपक्व मार्कर एमबीपी और पीएलपी 1 व्यक्त करते हुए)। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि अकेले आईओपीसी एमिलॉयड-β (एओ) की एक उल्लेखनीय मात्रा का स्राव करते हैं, जो स्वतंत्र ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के अनुरूप है, जो एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) की प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति और ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंशावली कोशिकाओं में प्रोसेसिंग प्रोटीज β-सेक्रेटेज (बीएसीई 1)को दर्शाता है। इसके अलावा, हमारी iN-iOPC सह-संस्कृति प्रणाली MBP-पॉजिटिव आईओएल प्रक्रियाओं द्वारा अक्षतंतु के आवरण को बढ़ावा देती है और सिनैप्स गठन के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करती है (चित्रा 3)। इस प्रकार, जिन प्रोटोकॉल को हमने नीचे विस्तृत किया है, उनमें पहले सूचीबद्ध न्यूरॉन-ऑलिगोडेंड्रोग्लिया सह-संवर्धन विधियों पर तकनीकी और जैविक फायदे हैं, और एडी में न्यूरोडीजेनेरेशन को बेहतर मॉडलिंग में एक वादा करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सिनैप्स संरचनाओं को स्थिर करने और माइलिनेशन द्वारा नमकीन संकेत चालन की सुविधा के लिए शारीरिक और चयापचय समर्थन के अलावा, ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंशावली कोशिकाएं न्यूरॉन्स 5,6,7 के साथ तेजी स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर00 एजी054616 से वाईएएएच और टी 32 जीएम 1365666 केसी), स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन और सिबेल फैलोशिप (एससी को सम्मानित) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। वाई.ए.एच. ब्राउन इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसलेशनल साइंसेज में सेंटर फॉर ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंस से एक जीएफएल ट्रांसलेशनल प्रोफेसर हैं।
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
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