Neuron-glial-interaksjonene i nevrodegenerasjon er ikke godt forstått på grunn av utilstrekkelige verktøy og metoder. Her beskriver vi optimaliserte protokoller for å oppnå induserte nevroner, oligodendrocytter forløperceller og oligodendrocytter fra humane pluripotente stamceller og gir eksempler på verdiene av disse metodene for å forstå celletypespesifikke bidrag i Alzheimers sykdom.
Ved Alzheimers sykdom (AD) og andre nevrodegenerative lidelser er oligodendroglial svikt et vanlig tidlig patologisk trekk, men hvordan det bidrar til sykdomsutvikling og progresjon, spesielt i hjernens grå substans, forblir stort sett ukjent. Dysfunksjonen av oligodendrocytter er preget av mangler i myelinisering og nedsatt selvfornyelse av oligodendrocytter forløperceller (OPC). Disse to feilene skyldes i det minste delvis forstyrrelsen av interaksjoner mellom nevron og oligodendrocytter langs oppbyggingen av patologi. OPC gir myeliniserende oligodendrocytter under CNS-utvikling. I den modne hjernebarken er OPCs de viktigste proliferative cellene (som består av ~ 5% av totale hjerneceller) og kontrollerer ny myelindannelse på en nevral aktivitetsavhengig måte. Slike neuron-til-oligodendrococyte-kommunikasjoner er betydelig understudert, spesielt i sammenheng med neurodegenerative tilstander som AD, på grunn av mangel på passende verktøy. I de senere år har vår gruppe og andre gjort betydelige fremskritt for å forbedre tilgjengelige protokoller for å generere funksjonelle nevroner og oligodendrocytter individuelt fra humane pluripotente stamceller. I dette manuskriptet beskriver vi våre optimaliserte prosedyrer, inkludert etablering av et samkultursystem for å modellere nevron-oligodendrocytterforbindelsene. Våre illustrerende resultater tyder på et uventet bidrag fra OPC / oligodendrocytter til hjerneamyloidose og synapseintegritet og fremhever nytten av denne metoden for AD-forskning. Denne reduksjonistiske tilnærmingen er et kraftig verktøy for å dissekere de spesifikke heterocellulære interaksjonene ut av den iboende kompleksiteten i hjernen. Protokollene vi beskriver her forventes å lette fremtidige studier på oligodendrogliale defekter i patogenesen av nevrodegenerasjon.
Oligodendrocytter avstamningsceller – inkludert oligodendrocytter forløperceller (OPC), myeliniserende oligodendrocytter og overgangstyper i mellom – utgjør en stor gruppe humane hjerneceller1 som aktivt deltar i mange kritiske funksjoner for riktig drift og vedlikehold av sentralnervesystemet gjennom nevral utvikling og aldring 2,3,4 . Mens oligodendrocytter er kjent for å produsere myelin for å lette nevronaktivitetsoverføring og støtte aksonal helse i hvit substans, er OPCs rikelig (~ 5%) i grå substans hvor myelinisering er knapp og utfører aktivitetsavhengige signalfunksjoner for å styre læringsadferd og minnedannelse 5,6,7,8 . Hvordan oligodendrogliale celler fungerer og dysfunksjon i patogenesen av Alzheimers sykdom (AD) og andre aldersassosierte nevrodegenerative tilstander har blitt studert9. Utilstrekkeligheten til et passende modellsystem og mangler i generell kunnskap for å lede en eksperimentell vei fremover er de viktigste årsakene til dette gapet.
I lys av de siste gjennombruddene i å utlede menneskelige hjerneceller fra pluripotente stamceller, inkludert embryonale stamceller (ES) og induserte pluripotente stamceller (iPS), har slike cellulære modeller i forbindelse med moderne genredigeringsverktøy dukket opp som robuste verktøy for å håndtere den intrikate sammenhengen mellom cellulære interaksjoner i hjernen, og er i stand til å demonstrere menneskespesifikke sykdomsmanifestasjoner10, 11. Med tanke på at individuelle hjernecelletyper kan utvise forskjellige og til og med motstridende effekter i møte med de samme AD-fremmende forholdene12,13, tilbyr denne stamcellemetodikken unikt celletypespesifikk informasjon som tidligere har blitt savnet ved hjelp av etablerte in vivo- eller in vitro-modeller som bare gir samlede avlesninger fra samlinger av hjernecelletyper. I løpet av det siste tiåret har et stort antall pålitelige protokoller blitt utviklet for å generere humane nevroner fra transdifferensiering av ES / iPS-celler eller direkte konvertering fra andre terminalt differensierte celletyper (f.eks. fibroblaster) 14,15. Spesielt kan anvendelsen av viktige nevrogene transkripsjonsfaktorer (f.eks. Neurogenin 2, Ngn2)16 til humane pluripotente stamceller generere en homogen populasjon av godt karakteriserte nevroncelletyper for rene kulturer uten behov for kokulturering med gliaceller12,17,18. For induserte humane oligodendrocytter er det noen få publiserte protokoller som kan generere funksjonelle celler som ligner deres primære kolleger, med et bredt spekter av effektivitet og etterspørsel i tid og ressurser 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Til dags dato har ingen av disse protokollene blitt brukt til å undersøke hvordan oligodendrogliale celler reagerer på og påvirker AD-patogenesen.
Her beskriver vi våre forbedrede protokoller for enkle og blandede kulturer av humaninduserte nevroner (iNs) og OPC / oligodendrocytter (iOPCs / iOLs). iN-protokollen beskrevet her er basert på den mye brukte Ngn2-tilnærmingen16, og har den ekstra funksjonen å være gliafri. De resulterende iN-ene er homogene og ligner sterkt på de kortikale lag 2/3 eksitatoriske nevronene, med karakteristisk pyramidemorfologi, genuttrykksmønster og elektrofysiologiske trekk17,18 (figur 1). For å overvinne noen av de grunnleggende barrierene i rettet differensiering av pluripotente stamceller, har vi utviklet en enkel og effektiv metode for lavdose dimetylsulfoksid (DMSO) forbehandling29,30, og rapportert en forbedret tilbøyelighet til humane ES / iPS-celler til å transdifferensiere til iOPCs og iOLs31, basert på en bredt tilpasset protokoll av Douvaras og Fossati 32 . Vi har ytterligere forenklet protokollen og innlemmet en robust differensieringsfremmende forbindelse, clemastine 7,33,34, for å akselerere prosessen med oligodendroglial modning. Som et resultat (figur 2) kan iOPCs genereres på 2 uker (~ 95% positive for markøren O4) og iOLs om fire uker (uttrykker modne markører MBP og PLP1). Interessant nok fant vi at iOPCs alene utskiller en bemerkelsesverdig mengde amyloid-β (Aβ), i samsvar med de uavhengige transkriptomiske dataene som viser rikelig ekspresjon av amyloidforløperproteinet (APP) og behandlingsproteasen β-sekretase (BACE1) i oligodendrococyttlinjeceller35,36. Videre fremmer vårt iN-iOPC-kokultursystem ensheathing av aksoner ved MBP-positive iOL-prosesser og gir betydelig støtte til synapsedannelse (figur 3). Dermed har protokollene vi har beskrevet nedenfor tekniske og biologiske fordeler i forhold til tidligere katalogiserte neuron-oligodendroglia co-culturing metoder, og holder et løfte om bedre modellering av nevrodegenerasjonen i AD.
I tillegg til den fysiske og metabolske støtten for å stabilisere synapsestrukturene og for å lette den saltatoriske signalledningen ved myelinisering, kan oligodendrocytterlinjeceller forme nevronaktivitetsmønster via raske og dynamiske krysssamtaler med nevroner 5,6,7. Mens oligodendroglialresponsene i AD-patologi i utgangspunktet ble ansett som bare sekundære til betennelse og oksidativt stress, er det nå lovende bevis …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R00 AG054616 til Y.A.H. og T32 GM136566 til K.C.), Stanford University School of Medicine og et Siebel Fellowship (tildelt SC). Y.A.H. er en GFL Translational Professor fra Center for Translational Neuroscience i Brown Institute for Translational Sciences.
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
PEI | VWR | 71002-812 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
SAG | Tocris | 4366 | |
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
VSV-G | Addgene | 12259 |