実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル
Summary
このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。
Abstract
実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)は、自己抗原に反応する免疫細胞によって引き起こされます。この非感染性の眼内炎症性疾患モデルの多くの特徴は、ヒトに影響を与える後部ブドウ膜炎の臨床表現型を再現しています。EAUは、新規炎症治療薬の有効性とその作用機序を研究し、眼内疾患の疾患進行を支えるメカニズムをさらに調査するために確実に使用されています。ここでは、C57BL/6Jマウス(この病気にかかりやすい最も広く使用されているモデル生物)におけるEAU誘導に関する詳細なプロトコルを提供します。疾患の重症度と進行の臨床評価は、眼底鏡検査、組織学的検査、フルオレセイン血管造影を使用して実証されます。誘導手順には、眼タンパク質光受容体レチノイド結合タンパク質(レチノール結合タンパク質3としても知られている)、完全フロイントアジュバント(CFA)からのペプチド(IRBP1-20)を含むエマルジョンの皮下注射が含まれ、死滅した結核菌が補充されます 。 首の後ろにこの粘性エマルジョンを注射した後、 百日咳菌 毒素を腹腔内注射します。症状の発症時(12〜14日目)および全身麻酔下で、臨床検査を通じて疾患の進行を評価するために眼底鏡画像を撮影します。これらのデータは、後の時点およびピーク疾患(20〜22日目)のデータと直接比較でき、違いを分析します。同時に、このプロトコルにより、研究者はフルオレセイン血管造影を使用して血管透過性と損傷の潜在的な違いを評価することができます。EAUは、野生型または遺伝子組み換えの両方の他のマウス系統で誘導することができ、薬効および/または疾患メカニズムを研究するための柔軟性を提供する新しい治療法と組み合わせることができます。
Introduction
このプロトコルは、C57BL / 6Jマウスで実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)を誘発する方法を実証します 乳化アジュバント中の網膜抗原の単回皮下注射による。疾患の進行を監視および評価する方法は、眼底鏡画像と組織学的検査を通じて詳細に説明され、測定パラメーターが概説されています。さらに、フルオレセイン血管造影、網膜血管構造および透過性を調べるための技術についても議論する。
このEAUモデルは、臨床病理学的特徴と疾患を引き起こす基本的な細胞および分子メカニズムに関して、ヒトにおける非感染性後部ブドウ膜炎の中心的な特徴を要約します。EAUは、養子導入実験およびIFNγ枯渇マウスで示されているように、自己反応性CD4+Tリンパ球のTh1および/またはTh17サブセットによって媒介されます1。ブドウ膜炎におけるこれらの細胞の潜在的な役割に関する私たちの理解の多くは、網膜組織内でTh1細胞とTh17細胞の両方が検出されるEAU2の研究から来ています3。多くの場合、EAUは、弱毒化疾患における新規治療法の有用性を評価するための前臨床モデルとして使用されます。EAU疾患の調節に成功した治療アプローチは、臨床である程度の有効性を示し、FDA承認のステータスに達しました。これらの例は、T細胞標的療法などの免疫調節薬のグループである:シクロスポリン、FK-506、およびラパマイシン4,5,6。最近、疾患の転帰に対するメカニズムと影響の両方を調査するために、このモデルで新しい経路を標的とする介入も検討されています。これらには、クロマチンリーダーブロモドメイン末端外(BET)タンパク質およびP-TEFb阻害剤を介した転写調節の標的化が含まれます3。さらに、VLA-4阻害剤などのより従来のアプローチは、最近、エフェクターCD4+ T細胞の調節を介したEAUにおける抑制を実証しました7。また、Th17細胞をRORγtインバースアゴニストであるTMP778で標的にすると、EAU8を有意に抑制することも見出されている。さらに、このモデルは、網膜の慢性自己免疫性炎症と、リンパ球プライミングなどの付随する根本的なメカニズムを研究する機会を提供します。
EAU前臨床試験の主な読み出しは、網膜眼底鏡検査イメージングを実行することによる臨床評価であり、光干渉断層撮影(OCT)による網膜の完全性を評価することによる頻度は低くなります。次に、フローサイトメトリーによる網膜細胞の網膜組織病理学的評価と免疫表現型検査が終了時に行われます。眼底鏡検査は、網膜全体の迅速かつ再現性のある臨床評価を可能にする使いやすいライブイメージングシステムです。免疫組織化学的評価のために、技術は網膜切片の準備に基づいており、炎症と構造的損傷の程度について組織構造を研究することができます9。使用されるすべての技術の評価基準と従来のスコアリングシステムは、このプロトコル内で概説されます。眼底鏡イメージングを使用して記録された損傷の程度は、しばしば組織学的変化と密接に相関しています。疾患の重症度を監視および評価するためのこの二重のアプローチにより、より高い感度と信頼性の高い測定結果が得られます。
EAUは、免疫介在性眼疾患の前臨床試験および調査に広く使用されている、確立されたモデルです。このモデルは、>95%の疾患発生率で信頼性が高く再現性があり、世界中の労働年齢失明の主な原因である眼内炎症性疾患の治療のための新しい治療法を検証または否定するために使用できる包括的なデータを生成します10。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験動物モデルは、疾患の病因の研究や新しい治療パラダイムの前臨床試験に必要なツールです。現在のプロトコルでは、眼内炎症性ブドウ膜炎の実験モデルであるEAUを誘導、モニタリング、およびスコアリングするための方法論について説明しました。このEAUモデルは、全ての手順が本明細書に概説されたプロトコールに従って実施された場合に95%を超える疾患発生率を有し、慢性の単相?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JGは、CBを支援するためにUCLインパクトスチューデントシップとローズツリートラストの資金を授与されました。VCは、Akari Therapeutics Inc.から研究協力助成金を受けていました。UCL眼科研究所の生物学的サービスユニット、特にアリソンオハラさんと彼女のチームの技術サポートに感謝します。
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
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