Summary
In questo rapporto presentiamo un protocollo che consente allo sperimentatore di generare un modello murino di uveite intraoculare. Più comunemente indicato come uveite autoimmune sperimentale (EAU), questo modello consolidato cattura molti aspetti della malattia umana. Qui, descriveremo come indurre e monitorare la progressione della malattia utilizzando diverse letture.
Abstract
L'uveite autoimmune sperimentale (EAU) è guidata dalle cellule immunitarie che rispondono agli auto-antigeni. Molte caratteristiche di questo modello di malattia infiammatoria intraoculare non infettiva ricapitolano il fenotipo clinico dell'uveite posteriore che colpisce l'uomo. L'EAU è stata utilizzata in modo affidabile per studiare l'efficacia di nuove terapie infiammatorie, la loro modalità d'azione e per studiare ulteriormente i meccanismi che sono alla base della progressione della malattia dei disturbi intraoculari. Qui, forniamo un protocollo dettagliato sull'induzione EAU nel topo C57BL / 6J - l'organismo modello più utilizzato con suscettibilità a questa malattia. La valutazione clinica della gravità e della progressione della malattia sarà dimostrata mediante fundoscopia, esame istologico e fluorangiografia. La procedura di induzione prevede l'iniezione sottocutanea di un'emulsione contenente un peptide (IRBP1-20) dalla proteina oculare interfotorecettore proteina legante i retinoidi (nota anche come proteina legante il retinolo 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) e integrata con Mycobacterium tuberculosis ucciso. L'iniezione di questa emulsione viscosa sul retro del collo è seguita da una singola iniezione intraperitoneale di tossina Bordetella pertussis . All'inizio dei sintomi (giorno 12-14) e in anestesia generale, vengono prelevate immagini fundoscopiche per valutare la progressione della malattia attraverso l'esame clinico. Questi dati possono essere confrontati direttamente con quelli dei timepoint successivi e del picco della malattia (giorno 20-22) con le differenze analizzate. Allo stesso tempo, questo protocollo consente allo sperimentatore di valutare le potenziali differenze nella permeabilità e nel danno dei vasi utilizzando l'angiografia con fluoresceina. L'EAU può essere indotta in altri ceppi murini - sia wildtype che geneticamente modificati - e combinata con nuove terapie che offrono flessibilità per studiare l'efficacia dei farmaci e/o i meccanismi della malattia.
Introduction
Questo protocollo dimostrerà come indurre l'uveite autoimmune sperimentale (EAU) nel topo C57BL/6J mediante una singola iniezione sottocutanea di un antigene retinico in un adiuvante emulsionato. I metodi per il monitoraggio e la valutazione della progressione della malattia saranno dettagliati attraverso l'imaging fundoscopico e l'esame istologico, con parametri di misurazione delineati all'interno. Inoltre, verrà discussa l'angiografia della fluoresceina, una tecnica per esaminare la struttura e la permeabilità dei vasi sanguigni retinici.
Questo modello EAU riassume le caratteristiche centrali dell'uveite posteriore non infettiva nell'uomo per quanto riguarda le caratteristiche clinico-patologiche e i meccanismi cellulari e molecolari di base che guidano la malattia. L'EAU è mediata da sottogruppi Th1 e/o Th17 di linfociti CD4+T autoreattivi, come mostrato in esperimenti di trasferimento adottivo e con topi impoveriti di IFNγ1. Gran parte della nostra comprensione dei potenziali ruoli di queste cellule nell'uveite deriva dallo studio dell'EAU2 in cui vengono rilevate sia le cellule Th1 che Th17 all'interno dei tessuti retinici3. Spesso, l'EAU viene utilizzata come modello preclinico per valutare l'utilità di nuove terapie nell'attenuare la malattia. Gli approcci terapeutici che hanno modulato con successo la malattia EAU hanno mostrato una certa efficacia nella clinica e hanno raggiunto lo stato approvato dalla FDA. Esempi di questi sono gruppi di farmaci immunoregolatori come le terapie mirate alle cellule T: ciclosporina, FK-506 e rapamicina 4,5,6. Recentemente, in questo modello sono stati esplorati anche interventi mirati a nuovi percorsi per studiare sia il meccanismo che l'effetto sull'esito della malattia. Questi includono la regolazione trascrizionale mirata attraverso il lettore di cromatina Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteine e inibitori P-TEFb3. Inoltre, approcci più convenzionali come un inibitore VLA-4 hanno recentemente dimostrato la soppressione nell'EAU attraverso la modulazione delle cellule T CD4+ effettrici7. Inoltre, il targeting delle cellule Th17 con TMP778, un agonista inverso RORγt, è stato trovato anche per sopprimere significativamente EAU8. Inoltre, questo modello offre l'opportunità di studiare l'infiammazione autoimmune cronica nella retina e i meccanismi sottostanti di accompagnamento come il priming dei linfociti.
Le letture primarie per gli studi preclinici EAU sono la valutazione clinica eseguendo l'imaging fundoscopia retinica e, meno frequentemente, valutando l'integrità retinica mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). La valutazione istopatologica retinica e l'immunofenotipizzazione delle cellule retiniche mediante citometria a flusso vengono quindi intraprese al termine. Fundoscopy è un sistema di live imaging facile da usare che consente una valutazione clinica rapida e riproducibile dell'intera retina. Per le valutazioni immunoistochimiche, le tecniche si basano sulla preparazione di sezioni retiniche che consentono di studiare l'architettura tissutale per il grado di infiammazione e danno strutturale9. I criteri di valutazione e i sistemi di punteggio convenzionali, per tutte le tecniche utilizzate, saranno delineati all'interno di questo protocollo. L'entità del danno registrato utilizzando l'imaging fundoscopico è spesso strettamente correlata ai cambiamenti istologici. Questo duplice approccio al monitoraggio e alla valutazione della gravità della malattia offre una maggiore sensibilità e risultati di misurazione più affidabili.
L'EAU è un modello consolidato e comunemente usato per i test preclinici e lo studio della malattia oculare immuno-mediata. Questo modello è affidabile e riproducibile con un'incidenza di malattia del >95% e genera dati completi che possono essere utilizzati per convalidare o ripudiare nuove terapie per il trattamento della malattia infiammatoria intraoculare che rappresenta una delle principali cause di cecità in età lavorativa in tutto il mondo10.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act del 1986 e le linee guida istituzionali dell'Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).
1. Alloggiamento mouse C57BL / 6J
- Topi domestici in un ambiente specifico privo di agenti patogeni, con un ciclo luce-buio di 12 ore e cibo e acqua disponibili ad libitum.
- Eseguire tutti gli esperimenti su femmine adulte C57BL/6J (le femmine sono scelte preferenzialmente in quanto vi è un'incidenza di donne rispetto agli uomini 1,4 a 1 nei pazienti con uveite). Randomizzare topi femmina C57BL / 6J tra 6-8 settimane di età in base al peso e all'età. Ospitare i topi in gabbie ventilate individualmente (IVC) in gruppi di 5-6 topi per gabbia.
2. Immunizzazione dei topi C57BL / 6
- IRBP1-20 - Preparazione dell'emulsione CFA
NOTA: La preparazione dell'emulsione è essenziale per la riproducibilità e l'incidenza della malattia; Pertanto, è necessario compiere ogni sforzo per mantenere la coerenza durante tutto il processo di preparazione e tra gli esperimenti. Quando si prepara l'emulsione, la perdita deve essere contabilizzata nei calcoli di tutti i reagenti in anticipo. Questa perdita può essere di circa 1,5 volte (o il 50% in più del volume preparato), in base al numero di topi pianificati per l'immunizzazione. Si prega di vedere il seguente esempio di seguito. Per immunizzare 10 topi, preparare 15 topi e utilizzare 400 μg (peptide per topo da 20 g) x 15 topi = 6 mg. Ogni topo dovrebbe ricevere 200 μL per l'immunizzazione (3 ml totali). Il volume finale comprende un rapporto 1: 1 di soluzione peptidica e CFA, quindi 1,5 ml di soluzione peptidica e 1,5 ml di CFA.- Preparare tutte le soluzioni sterili in una cabina a flusso laminare utilizzando tecniche asettiche.
- Pesare la quantità desiderata (400 μg per 20 g di topo) di IRBP1-20 umano (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) peptide liofilizzato. Sciogliere il peptide in DMSO al 100%. Conservare le scorte in forma liofilizzata a -20 °C.
NOTA: Per garantire che la polvere sia completamente sciolta, ogni scaglia deve prima entrare in contatto con il DMSO e non mostrare alcun segno di solido residuo. Aggiungi PBS in piccole porzioni per raggiungere il volume finale. Non mescolare con un vortice, ma usare una leggera agitazione con una pipetta. La concentrazione finale di DMSO non deve superare l'1% del volume totale di preparazione peptidica. La preparazione dell'emulsione in un tubo di plastica da 20 ml con un fondo affusolato dovrebbe consentire una migliore accessibilità del DMSO alla polvere liofilizzata. - Aggiungere la soluzione peptidica DMSO-PBS a 1:1 v/v al CFA che è già stato integrato con 1,5 mg/mL ucciso Mycobacterium tuberculosis , per dare una concentrazione finale di 2,5 mg/ml. Aggiungere goccia a goccia, pipettando delicatamente e frequentemente per formare un'emulsione viscosa e uniformemente distribuita.
- Aerare la soluzione peptidica e CFA utilizzando una pipetta da 1000 μL (impostata su 700 μL per evitare ulteriori perdite) e una pipetta per generare una consistenza cremosa e densa. Questa tecnica prevede l'utilizzo della pipetta per aspirare ripetutamente su e giù fino a raggiungere lo spessore desiderato. Per risultati ottimali, assicurarsi che la soluzione di antigene e l'adiuvante siano miscelati accuratamente prima dell'iniezione.
- Iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse
- Sospendere 1,5 μg di tossina Bordetella pertussis in 100 μL di RPMI 1640 terreno integrato con siero di topo all'1% 11.
- Eseguire l'iniezione i.p. con una siringa sterile e un ago da 23G.
NOTA: Al fine di evitare disturbi al sito di iniezione, la tossina della pertosse deve essere somministrata prima di iniettare l'antigene. - Trasferire temporaneamente ogni topo in una gabbia separata per ricevere una singola iniezione i.p. da 100 μL di tossina Bordetella pertussis .
- Iniezione sottocutanea di emulsione IRBP
- Quindi, iniettare l'emulsione IRBP per via sottocutanea. Questo processo richiede due addestratori di animali adeguatamente vestiti con protezione secondo le norme di salute e sicurezza.
- Chiedi a una persona addestrata di trattenere leggermente il topo sulla parte superiore della gabbia in una posizione simile a una collottola, con lo stomaco rivolto verso il basso mentre l'altra persona addestrata pizzica la pelle per formare una struttura simile a una tenda sulla parte posteriore del collo in cui l'ago può essere inserito per infilare tra il dito e il pollice.
ATTENZIONE: C'è il pericolo di lesioni da puntura d'ago. - Una volta posizionato l'ago, iniettare 200 μL di emulsione IRBP. Quando si rimuove l'ago, ruotare la testina dell'ago per chiudere la pelle prima di estrarlo e applicare successivamente pressione sul sito di iniezione per prevenire il reflusso dell'emulsione.
ATTENZIONE: L'emulsione non deve entrare in contatto con la pelle o il pelo del topo in quanto ciò potrebbe causare irritazione e, nei casi più gravi, lo sviluppo di una lesione. Se ciò si verifica, l'area deve essere pulita immediatamente e accuratamente utilizzando etanolo al 70%, quindi asciugata.
NOTA: Se i linfonodi drenanti sono necessari per l'esame alla fine dello studio, il sito di iniezione sarà diverso. In questo caso, iniettare 100 μL su entrambi i lati del fianco per via sottocutanea. Ciò genererà una risposta più forte ai linfonodi inguinali drenanti, che possono essere asportati al momento della raccolta. Tuttavia, se il risultato atteso è esclusivamente quello di sviluppare EAU, una singola iniezione di 200 μL nella parte posteriore del collo è preferibile per evitare il disagio da più siti di iniezione.
3. Valutazione clinica - Esame del fondo oculare del topo
NOTA: La malattia clinica deve essere valutata utilizzando l'esame del fondo oculare, tramite imaging live a campo chiaro utilizzando un fundoscopio e il software Discover utilizzato per la visualizzazione.
- All'esordio della malattia (giorno 12-14), sedare i topi in anestesia generale usando una combinazione di ketamina (50 mg/ml) e Domitor (Medetomidina; 1 mg/ml). Diluire Domitor in 1 parte; 1,5 parti di ketamina e 2,5 parti di acqua iniettabile sterile, quindi iniettare 100 μL per 30 g per via intraperitoneale. Utilizzare 1 mL di siringhe sterili e aghi da 23G per la suddetta combinazione di anestesia.
- Successivamente, monitorare il mouse per assicurarsi che tutti i riflessi siano persi e che non risponda agli stimoli.
- Immediatamente dopo aver ricevuto l'iniezione i.p. e mentre il topo è ancora tenuto in una collottola, applicare topicamente l'1% di tropicamide e il 2,5% di fenilefrina su ciascun occhio per la dilatazione della pupilla. Mirare a coprire completamente la cornea con entrambe le soluzioni dilatatorie. Potrebbero essere necessari alcuni minuti prima che la pupilla sia completamente dilatata.
- Successivamente, applicare generosamente sull'unguento viscoteare oculare e mantenere durante tutto il processo di imaging al fine di mantenere l'occhio completamente lubrificato e idratato.
- Nel frattempo, apri il software (ad esempio, Discover) e imposta il fundoscopio (ad esempio, Micron) per catturare immagini in campo chiaro. Assegna a ogni singolo mouse una cartella ed etichetta le immagini con R o L in base a ciascun occhio fotografato.
- Montare il mouse su un palco appositamente costruito per la visualizzazione dal vivo e posizionare il microscopio per un accesso completo alla retina.
- Per ottenere una rappresentazione accurata della malattia, scattare immagini dell'intera area retinica, coprendo tutti gli angoli della periferia oltre al disco ottico. Per ottenere ciò, regolare l'oculare in tutto. È fondamentale che l'occhio rimanga completamente lubrificato in ogni momento durante il processo di imaging; Assicurati questo rabboccando l'unguento per gli occhi a una velocità costante.
- Fare riferimento al paragrafo 4 (sotto) in questa fase per eseguire l'angiografia con fluoresceina.
- Una volta completata l'imaging, diluire l'anti-sedazione anestetica inversa (5 mg/mL Antisedan) in acqua iniettabile e somministrare a 0,1 mg/kg i.p. Riportare il mouse in una gabbia e posizionarlo su un tappetino preriscaldato con accesso a una dieta imbevuta di umidità fino al recupero. Il recupero completo è caratterizzato dal movimento di tutto il corpo e dal camminare intorno alla gabbia con andatura costante, in genere impiegando alcune ore.
- All'endpoint sperimentale designato (ad esempio, giorno 21-23), ripetere i passaggi 4.1-4.5 e scattare nuovamente fotografie dell'intera area retinica, coprendo il disco ottico e tutti gli angoli della periferia per catturare una rappresentazione accurata della malattia.
4. Fluorangiografia
- Per misurare la perdita dei vasi in questi animali, mentre sono sotto anestesia, somministrare a ciascun topo un'iniezione di fluoresceina al 2% per via sottocutanea nella parte posteriore del collo e posizionarla in modo tale che la retina sia centralizzata al centro dell'immagine dal vivo.
- Impostare il fundoscopio su un filtro di eccitazione a luce blu a 465-490 nm. La luce catturata dalla fluoresceina eccitata è compresa tra 520-530 nm.
- Dopo 1,5 minuti dopo l'iniezione di fluoresceina, scattare una fotografia di ciascuna retina e ripetere di nuovo a 7 minuti.
NOTA: il tempismo è fondamentale per questi eventi, se non è possibile catturare entrambi, è sufficiente visualizzare un occhio.
5. Punteggio clinico della malattia
- Basare la valutazione clinica sulla gravità dei seguenti criteri: infiammazione del disco ottico, cuffing dei vasi retinici, infiltrato di tessuto retinico e danno strutturale.
- Assegna a ciascuno di questi parametri un punteggio su una scala da 0 a 5 e il totale collettivo è rappresentativo della malattia clinica per l'intero occhio, con un punteggio massimo di 20 ottenibile per occhio. La tabella 1 può essere utilizzata come guida per i criteri di punteggio.
6. Istologia e punteggio istologico
- Dopo l'eutanasia dei topi per lussazione cervicale, enucleare gli occhi separando le palpebre per un facile accesso a tutto l'occhio.
- Quindi, posizionare una pinza curva dietro il globo con l'intenzione di afferrare il tessuto connettivo orbitale e il nervo ottico. Fare attenzione a evitare di spremere il globo.
- Per la fissazione, posizionare l'occhio in glutaraldeide al 4% per un minimo di 15 minuti per ridurre al minimo il distacco di retina, quindi trasferire al 10% di formaldeide per almeno 24 ore. 1-2 ml di fissativo darebbero abbastanza volume per coprire due occhi.
- Eseguire l'incorporamento in paraffina, il sezionamento su un microtomo e la colorazione secondo protocolli standard. Lo spessore della sezione di 3-4 μm è consigliato per qualsiasi tipo di colorazione.
- Eseguire l'esame istologico degli occhi utilizzando protocolli standard per la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E).
- Assegnare punteggi su una scala da 0 a 4, secondo i criteri per il punteggio EAU, in base all'estensione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie all'interno della retina e della coroide, alla rottura degli strati retinici, al grado di formazione del granuloma e all'estensione del distacco della retina, indicando il danno retinico, come precedentemente descritto (Agarwal 2013) e riassunto nella tabella 211.
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Representative Results
In questo protocollo, descriviamo un metodo passo-passo per indurre un modello di uveite autoimmune sperimentale (EAU) immunizzando topi con un peptide retinico uveitogenico derivato da IRBP. La valutazione della malattia che impiega approcci ampiamente utilizzati e facilmente accessibili è coperta sebbene questi non siano esclusivi e possano essere aggiunti, o parzialmente sostituiti, da altre tecniche di imaging. I primi segni di EAU nei topi C57BL/6J possono essere rilevati due settimane dopo l'immunizzazione e il picco di malattia raggiunto entro tre settimane, come illustrato nella Figura 1. I cambiamenti fundoscopici sono classificati durante la progressione della malattia come cambiamenti infiammatori, che includono il tessuto retinico, l'infiammazione del disco vascolare e ottico e il danno strutturale retinico (Figura 2) oltre ai cambiamenti istologici basati sull'infiltrazione delle cellule immunitarie e sul danno strutturale. Questi cambiamenti clinici e istopatologici possono essere rilevati fino a 85 giorni dopo l'immunizzazione e classificati e valutati per la valutazione propongono di studiare la progressione della malattia. Al fine di evitare pregiudizi involontari nel punteggio visivo qualitativo, le immagini dovrebbero essere valutate da più di un esperto e i punteggi devono essere ciechi ai gruppi di trattamento.
Mostriamo qui come i sistemi di punteggio clinico e istologico (Tabella 1 e Tabella 2) guidano gli scienziati a quantificare la gravità dell'EAU, a convalidare l'efficacia dei trattamenti e ad esplorare il meccanismo d'azione dei farmaci. La perdita vascolare è anche una caratteristica patologica del modello e nell'uveite umana. Stiamo mostrando esempi di perdita vascolare di fluoresceina (Figura 3) come un altro metodo per valutare la malattia in questo modello.
Figura 1. Cronologia schematica della progressione clinica e istologica della malattia nell'EAU indotta da IRBP1-20 . Una linea temporale che segna l'inizio dell'infiltrazione e la progressione dell'EAU indotta da IRBP1-20 verso il picco della malattia. Dall'immunizzazione, i primi segni di malattia clinica, rilevati dall'imaging fundoscopico e dall'analisi istopatologica, cadono tra i giorni 12-14. La malattia continuerà quindi a progredire, secondo questi parametri, fino a raggiungere un picco intorno al giorno 21-23. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Immagini fundoscopiche rappresentative correlate con sezioni istologiche in diversi stadi della malattia EAU indotta da IRBP1-20 nei topi C57BL/6J. Immagini fundoscopiche cliniche e corrispondenti di C57BL/6J dello stesso animale immunizzato con peptide IRBP 1-20. (A e B) immagini fundoscopiche e sezioni istologiche dell'occhio ottenute da topi sani e CFA iniettati. La retina non ha alcun segno di infiammazione e le corrispondenti sezioni istologiche mostrano strati retinici conservati. (C) L'immagine fessoscopica dell'occhio ottenuta dal topo C57BL/6J 14 giorni dopo l'immunizzazione mostra segni classici di EAU, che si presentano con grave gonfiore del disco ottico nella fase iniziale della malattia, l'istologia corrispondente mostra cellule immunitarie infiltranti nello spazio vitreo. (D) Le immagini fundoscopiche dell'occhio ottenute dal topo C57BL/6J 21 giorni dopo l'immunizzazione mostrano segni di bracciale dei vasi e popolazioni immunitarie infiltranti. I dati istologici dimostrano gravi cambiamenti strutturali dovuti al ripiegamento della retina (frecce gialle). V= vaso, O= disco ottico, R=retina, L=lente, Vit=vitreo,iO= disco ottico infiammato, iV= vaso infiammato, iR= retina infiammata, i= cellule infiltranti nel vitreo, RFs=pieghe retiniche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Immagini rappresentative di angiografia fluorescente scattate utilizzando il sistema di imaging Micron III al picco della malattia. I topi C57BL / 6J sono stati iniettati per via sottocutanea con fluoresceina al 2% e immagini prese in vari punti temporali dopo la circolazione del tracciante. (A) CFA solo topo di controllo prelevato a 1,5 e 7 minuti dopo la somministrazione di fluoresceina. (B) Immagini rappresentative di topi immunizzati IRBP1-20 prelevati rispettivamente 1,5 e 7 minuti dopo aver ricevuto fluoresceina. La freccia bianca indica la perdita del serbatoio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Punteggio | Disco ottico | Vasi retinici | Infiltrato di tessuto retinico | Danni strutturali | ||||
| 1 | Infiammazione minima | 1-4 polsini delicati | 1-4 piccole lesioni o 1 lesione lineare | Lesioni retiniche o atrofia retinica che coinvolgono da 1/4 a 3/4 dell'area retinica | ||||
| 2 | Lieve infiammazione | >4 manette lievi o 1-3 manette moderate | 5-10 piccole lesioni o 2-3 lesioni lineari | Atrofia panretinica con lesioni multiple piccole (cicatrici) o lesioni lineari <3 (cicatrici) | ||||
| 3 | Infiammazione moderata | >3 manette moderate | >10 piccole lesioni o >3 lesioni lineari | Atrofia panretinica con >3 lesioni lineari o lesioni confluenti (cicatrici) | ||||
| 4 | Grave infiammazione | >1 ammanettamento grave | Lesione lineare confluente | Distacco di retina con pieghevole | ||||
| 5 | * Non visibile (white out o distacco estremo) | * Non visibile (white out o distacco estremo) | * Non visibile (white out o distacco estremo) | * Non visibile (white out o distacco estremo) | ||||
Tabella 1. Scala di punteggio clinico convenzionale per la valutazione della gravità della malattia clinica EAU. Tabella che mostra i criteri utilizzati per valutare l'entità della gravità della malattia nei topi immunizzati con IRBP1-20. I punteggi sono stati assegnati in base ai segni distintivi sopra delineati essendo visibili sulle immagini del fondo oculare, a ciascun occhio è stato assegnato un punteggio totale su venti. * A causa dell'oscuramento dell'infiltrato e del distacco di retina all'interno della camera posteriore non può essere valutato. Tabella adattata con il permesso di Xu H., et al., 20088.
| Grado | Criteri |
| 0 | Nessuna modifica |
| 0.5 (traccia) | Lieve infiltrazione di cellule infiammatorie. Nessun danno tissutale |
| 1 | Infiltrazione; pieghe retiniche e distacchi focali di retina; pochi piccoli granulomi nella coroide e nella retina, perivasculite |
| 2 | Infiltrazione moderata; pieghe retiniche, distacchi e danno alle cellule dei fotorecettori focali; granulomi di piccole e medie dimensioni, perivasculite e vasculite |
| 3 | Infiltrazioni medio-pesanti; ampio ripiegamento retinico con distacchi, danno cellulare moderato dei fotorecettori; lesioni granulomatose di medie dimensioni; Neovascolarizzazione sottoretinica |
Tabella 2. EAU con punteggio istologico
Tabella che mostra i criteri utilizzati per valutare la gravità dell'EAU sulla base delle caratteristiche istopatologiche della malattia. I punteggi sono stati assegnati in base ai segni distintivi sopra delineati sulla colorazione H & E, a ciascun occhio è stato assegnato un punteggio totale su quattro. Tabella adattata con il permesso di Agarwal et al. 201311.
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Discussion
I modelli animali sperimentali sono strumenti necessari per lo studio della patogenesi della malattia e la sperimentazione preclinica di nuovi paradigmi terapeutici. Nel protocollo attuale, abbiamo discusso una metodologia per indurre, monitorare e valutare EAU, un modello sperimentale di uveite infiammatoria intraoculare. Questo modello EAU ha un'incidenza di malattia superiore al 95% quando tutte le procedure vengono eseguite secondo il protocollo qui delineato e si traduce nello sviluppo di EAU cronica e monofasica. Per raggiungere questo livello di incidenza, sottolineiamo l'importanza della preparazione dell'antigene e dell'iniezione dell'emulsione, entrambi descritti sopra. Le caratteristiche principali dell'EAU negli animali sono l'infiammazione retinica e/o coroideale, la vasculite retinica, la distruzione dei fotorecettori e la perdita della vista, che rappresentano molte caratteristiche clinicopatologiche essenziali dell'uveite posteriore umana12. Gran parte della comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di base coinvolti nell'uveite deriva dal modello EAU indotto come descritto nel presente documento. L'EAU può essere indotta nei topi13 e nei ratti11 mediante immunizzazione attiva con antigeni retinici riconosciuti dai linfociti. Questi antigeni retinici assumono molte forme; IRBP (per topi) o antigene solubile retinico (S-Ag) per ratti. L'induzione di EAU su uno sfondo C57BL / 6J genera una forma più cronica della malattia, con un picco di patologia osservato tre settimane dopo l'immunizzazione. In confronto, l'applicazione dell'antigene retinico a uno sfondo B10RIII14 induce una forma acuta-monofasica e clinicamente grave di EAU in cui la patologia di picco si presenta tipicamente entro due settimane dall'induzione e la malattia si attenua entro la settimana 3.
Diversi epitopi IRBP sono stati testati in topi C57BL / 6J e il peptide IRBP1-20 ha dimostrato di essere un modello riproducibile con alti livelli di incidenza e gravità. Recentemente è stato riportato che un nuovo epitopo uveitogenico dell'IRBP, i residui di aminoacidi da 651 a 670 di IRBP umano inducono EAU con una maggiore incidenza clinica e una grave manifestazione di malattia11 e possono essere utilizzati in preferenza se ciò soddisfa gli obiettivi scientifici. Poiché è noto che l'impatto del microbiota commensale intestinale e l'attivazione dei recettori delle cellule T autoreattive (TCR) interferiscono con l'insorgenza della malattia quando si applicano diversi antigeni15, raccomandiamo ai principianti in questo campo di utilizzare peptidi hIRBP1-20 o hIRBP651-670 a una dose titolata tra 300-500 μg al fine di ottenere un modello affidabile. In effetti, la variabilità in questo modello è stata documentata altrove con rapporti che evidenziano l'importanza delle differenze tra i sistemi di stabulazione e il microbioma che potrebbero influire sulla gravità e sull'incidenza della malattia15. Pertanto, possono essere necessari più o meno l'antigene peptidico e la tossina della pertosse.
Ci sono un certo numero di altri modelli a cui può essere eseguita la nostra analisi descritta. Questi includono l'uveite spontanea che progredisce nei topi transgenici (R161H) del recettore delle cellule T IRBP (TCR) in cui l'infiammazione oculare si sviluppa entro 5-6 settimane di età16. L'EAU può anche essere indotta adottivamente trasferendo cellule CD4+T effettrici uveitogeniche. Le cellule CD4+T attivate, specifiche per IRBP, derivate da topi innescati possono essere utilizzate come fonte di cellule effettrici 3,11. Questo modello rappresenta la fase effettrice della malattia evitando le complessità dell'uso di CFA nel modello inducibile.
Oltre a questo, ci sono molti vantaggi nell'utilizzare modelli infiammatori oculari come strumenti appropriati per studiare altre malattie infiammatorie, in particolare, quelle con patologia del sottogruppo effettore Th1 e Th17. I principali vantaggi dell'utilizzo di questo modello sono i metodi non invasivi e quantificabili per monitorare lo sviluppo e la progressione della malattia, che sono la fundoscopia e l'angiografia. Questi sistemi di imaging non invasivi consentono un facile accesso ai tessuti neuronali, che altrimenti sarebbero nascosti dietro barriere anatomiche protettive. Ulteriori metodi per monitorare la progressione della malattia includono l'applicazione dell'imaging OCT, che è più sensibile dell'imaging fundoscopico nel rilevare infiltrati cellulari, specialmente nella fase iniziale dell'insorgenza dell'EAU. La tecnica consente visualizzazioni trasversali e orizzontali multistrato della retina longitudinalmente e in modo non invasivo. In vivo L'imaging OCT aggiunge informazioni sullo spessore della retina che non è stato possibile ottenere mediante esami fundoscopici e istologici17. Sempre più spesso, la disponibilità di tecniche di imaging non invasive ancora più sofisticate, come l'oftalmoscopia laser a scansione ottica adattiva e gli strumenti di imaging multimodale, migliorerà ulteriormente la nostra capacità di studiare questa malattia nei piccoli roditori. Inoltre, la capacità di sezionare e isolare popolazioni cellulari residenti e infiltranti per un'analisi più approfondita degli immunofenotipi, utilizzando tecniche come la citometria a flusso, offre grandi opportunità per fornire informazioni approfondite.
Esistono alcuni sistemi di punteggio stabiliti basati su criteri clinici ottenuti dalla fundoscopia 8,9,18. Sebbene questi differiscano leggermente tra i centri di ricerca oftalmologica, tutti sono affidabili, correlati con caratteristiche istopatologiche e sono in grado di riflettere accuratamente la gravità della malattia. Nel presente studio, ci riferiamo al sistema di punteggio sviluppato da Xu et al.8. Questo sistema offre un approccio di valutazione più dettagliato con un numero maggiore di parametri di misurazione clinica. Comprende un punteggio massimo di 20 che introduce una finestra di punteggio più ampia rispetto ai sistemi alternativi limitata a un massimo di 5. Questo è più importante per ulteriori esplorazioni all'interno degli approcci terapeutici. Ridurre al minimo l'errore dell'operatore, tuttavia, è fondamentale quando si utilizza un insieme di parametri così raffinato e dettagliato e può richiedere un'attenta formazione dell'operatore e una convalida indipendente dell'interpretazione.
Qui, presentiamo un protocollo per indurre EAU in topi femmina C57BL / 6 in quanto vi è una maggiore incidenza di donne: uomini 1.4: 1 che presentano uveite in ambito clinico. Tuttavia, il sesso dei topi utilizzati per indurre la malattia autoimmune dovrebbe essere considerato in quanto ciò può influenzare l'ambiente delle citochine11 e anche rivelare importanti differenze nel modo in cui rispondono all'intervento terapeutico. Un'altra considerazione è l'età dei topi all'induzione della malattia. Ad esempio, abbiamo studiato la dipendenza dall'età della suscettibilità nei topi B10RIII e abbiamo concluso che i topi oltre le 8 settimane di vita hanno una minore incidenza di EAU (studio non pubblicato dal nostro gruppo).
In conclusione, i modelli animali di malattia intraoculare hanno fornito uno strumento inestimabile per studiare l'uveite posteriore umana e hanno facilitato lo sviluppo di nuove terapie come la CsA. Tuttavia, nessun modello animale da solo riproduce l'intero spettro dell'uveite umana, poiché ognuno ha caratteristiche uniche che lo rendono adatto allo studio di particolari aspetti della malattia. Questo modello EAU è indotto dall'autoimmunità attraverso l'applicazione del peptide IRBP integrato con adiuvanti che innescano risposte immunitarie innate. Tuttavia, non è noto se tutte le forme di uveite posteriore nell'uomo siano autoimmuni e se il mimetismo antigenico sia un fattore scatenante. Inoltre, non è chiaro se vi sia un'associazione con l'infezione nell'innescare l'uveite umana. Tuttavia, il modello qui descritto è un modello generico utile e riproducibile che può essere utilizzato per raccogliere informazioni utili sull'eziologia, la patogenesi e la terapia di questa malattia pericolosa per la vista.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare con quest'opera.
Acknowledgments
JG ha ricevuto un finanziamento UCL Impact Studentship e Rosetrees Trust per sostenere CB. VC ha ricevuto una sovvenzione collaborativa di ricerca da Akari Therapeutics Inc. Vorremmo ringraziare l'UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit in particolare la signora Alison O'Hara e il suo team per il loro supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
