Eksperimentel autoimmun uveitis: En intraokulær inflammatorisk musemodel
Summary
I denne rapport præsenterer vi en protokol, der gør det muligt for efterforskeren at generere en musemodel af intraokulær uveitis. Mere almindeligt omtalt som eksperimentel autoimmun uveitis (EAU), fanger denne etablerede model mange aspekter af menneskelig sygdom. Heri vil vi beskrive, hvordan man inducerer og overvåger sygdomsprogression ved hjælp af flere aflæsninger.
Abstract
Eksperimentel autoimmun uveitis (EAU) drives af immunceller, der reagerer på selvantigener. Mange træk ved denne ikke-infektiøse, intraokulære inflammatoriske sygdomsmodel rekapitulerer den kliniske fænotype af posterior uveitis, der påvirker mennesker. EAU er blevet brugt pålideligt til at studere effekten af nye inflammatoriske behandlinger, deres virkningsmekanisme og til yderligere at undersøge de mekanismer, der understøtter sygdomsprogression af intraokulære lidelser. Her giver vi en detaljeret protokol om EAU-induktion i C57BL/6J-musen – den mest anvendte modelorganisme med modtagelighed for denne sygdom. Klinisk vurdering af sygdommens sværhedsgrad og progression vil blive demonstreret ved hjælp af fundoskopi, histologisk undersøgelse og fluorescein angiografi. Induktionsproceduren involverer subkutan injektion af en emulsion indeholdende et peptid (IRBP1-20) fra det okulære protein interfotoreceptor retinoidbindende protein (også kendt som retinolbindende protein 3), Complete Freunds Adjuvans (CFA) og suppleret med dræbt Mycobacterium tuberculosis. Injektion af denne viskøse emulsion på bagsiden af nakken efterfølges af en enkelt intraperitoneal injektion af Bordetella pertussis-toksin . Ved symptomdebut (dag 12-14) og under generel anæstesi tages fundoskopiske billeder for at vurdere sygdomsprogression gennem klinisk undersøgelse. Disse data kan sammenlignes direkte med dem på senere tidspunkter og peak disease (dag 20-22) med forskelle analyseret. Samtidig giver denne protokol efterforskeren mulighed for at vurdere potentielle forskelle i karpermeabilitet og skade ved hjælp af fluorescein angiografi. EAU kan induceres i andre musestammer – både vildtype eller genetisk modificeret – og kombineres med nye terapier, der giver fleksibilitet til at studere lægemiddeleffektivitet og / eller sygdomsmekanismer.
Introduction
Denne protokol vil demonstrere, hvordan man inducerer eksperimentel autoimmun uveitis (EAU) i C57BL/6J-musen ved en enkelt subkutan injektion af et retinalt antigen i en emulgeret adjuvans. Metoder til overvågning og vurdering af sygdomsprogression vil blive detaljeret gennem fundoskopisk billeddannelse og histologisk undersøgelse med måleparametre skitseret indeni. Derudover vil fluorescein angiografi, en teknik til undersøgelse af retinal blodkarstruktur og permeabilitet blive diskuteret.
Denne EAU-model rekapitulerer centrale træk ved ikke-infektiøs posterior uveitis hos mennesker med hensyn til klinisk-atologiske egenskaber og de grundlæggende cellulære og molekylære mekanismer, der driver sygdom. EAU medieres af Th1- og/eller Th17-undergrupper af selvreaktive CD4+T-lymfocytter, som vist i adoptivoverførselsforsøg og med IFNγ-depleterede mus1. Meget af vores forståelse af disse cellers potentielle roller i uveitis kommer fra at studere EAU2, hvor både Th1- og Th17-celler detekteres i nethindevævet3. Ofte bruges EAU som en præklinisk model til at vurdere nytten af nye terapier til dæmpning af sygdom. Terapeutiske tilgange, der med succes har moduleret EAU-sygdom, har vist en vis effektivitet i klinikken og nået FDA-godkendt status. Eksempler på disse er grupper af immunregulerende lægemidler såsom T-cellemålretningsterapier: cyclosporin, FK-506 og rapamycin 4,5,6. For nylig er interventioner rettet mod nye veje også blevet undersøgt i denne model for at undersøge både mekanisme og effekt på sygdomsresultatet. Disse omfatter målretning transkriptionel regulering gennem kromatinlæser, Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteiner og P-TEFb-hæmmere3. Desuden har mere konventionelle tilgange såsom en VLA-4-hæmmer for nylig vist undertrykkelse i EAU via modulering af effektor CD4 + T-celler7. Derudover har målretning af Th17-celler med TMP778, en RORγt invers agonist, også vist sig at undertrykke EAU8 betydeligt. Desuden giver denne model mulighed for at studere kronisk autoimmun inflammation i nethinden og de ledsagende underliggende mekanismer såsom lymfocytpriming.
De primære udlæsninger til EAU prækliniske undersøgelser er klinisk vurdering ved at udføre retinal fundoskopibilleddannelse og mindre hyppigt ved at vurdere retinal integritet ved optisk kohærenstomografi (OCT). Retinal histopatologisk evaluering og immunofænotypning af retinale celler ved flowcytometri udføres derefter ved afslutning. Fundoskopi er et brugervenligt levende billeddannelsessystem, der giver mulighed for hurtig og reproducerbar klinisk vurdering af hele nethinden. Til immunohistokemiske vurderinger er teknikkerne baseret på forberedelse af retinale sektioner, der giver os mulighed for at studere vævsarkitektur for graden af inflammation og strukturel skade9. Vurderingskriterierne og de konventionelle pointsystemer for alle anvendte teknikker vil blive beskrevet i denne protokol. Omfanget af skader registreret ved hjælp af fundoskopisk billeddannelse korrelerer ofte tæt med histologiske ændringer. Denne dobbelte tilgang til overvågning og vurdering af sygdommens sværhedsgrad giver større følsomhed og mere pålidelige måleresultater.
EAU er en veletableret, almindeligt anvendt model til præklinisk test og undersøgelse af immunmedieret øjensygdom. Denne model er pålidelig og reproducerbar med >95% sygdomsforekomst og genererer omfattende data, der kan bruges til at validere eller afvise nye terapier til behandling af intraokulær inflammatorisk sygdom, der repræsenterer en væsentlig årsag til blindhed i den erhvervsaktive alderpå verdensplan 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimentelle dyremodeller er nødvendige værktøjer til at studere sygdomspatogenese og præklinisk afprøvning af nye terapeutiske paradigmer. I den nuværende protokol har vi diskuteret en metode til inducering, overvågning og scoring af EAU, en eksperimentel model af intraokulær inflammatorisk uveitis. Denne EAU-model har mere end 95% sygdomsforekomst, når alle procedurer udføres i henhold til protokollen beskrevet heri, og resulterer i udvikling af kronisk, monofasisk EAU. For at opnå dette incidensniveau un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG blev tildelt en UCL Impact Studentship og Rosetrees Trust finansiering til støtte for CB. VC modtog et forskningssamarbejdsstipendium fra Akari Therapeutics Inc. Vi vil gerne takke UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, især fru Alison O’Hara og hendes team for deres tekniske support.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
