אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית: מודל עכבר דלקתי תוך עיני
Summary
בדו”ח זה אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר ליצור מודל עכבר של אובאיטיס תוך עינית. מודל מבוסס זה, המכונה בדרך כלל אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU), לוכד היבטים רבים של מחלות אנושיות. במאמר זה נתאר כיצד לגרום ולנטר את התקדמות המחלה באמצעות מספר קריאות.
Abstract
אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU) מונעת על ידי תאי מערכת החיסון המגיבים לאנטיגנים עצמיים. תכונות רבות של מודל מחלות דלקתיות תוך עיניות לא זיהומיות אלה משחזרות את הפנוטיפ הקליני של אובאיטיס אחורית המשפיעה על בני אדם. EAU שימש באופן אמין כדי לחקור את היעילות של טיפולים דלקתיים חדשניים, את אופן הפעולה שלהם ולחקור עוד יותר את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות המחלה של הפרעות תוך עיניות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט על השראת EAU בעכבר C57BL/6J – אורגניזם המודל הנפוץ ביותר עם רגישות למחלה זו. הערכה קלינית של חומרת המחלה והתקדמותה תודגם באמצעות פונדוסקופיה, בדיקה היסטולוגית ואנגיוגרפיה פלואורסצאין. הליך האינדוקציה כולל הזרקה תת עורית של תחליב המכיל פפטיד (IRBP1-20) מחלבון העין אינטרפוטורצפטור רטינואיד (הידוע גם בשם חלבון קושר רטינול 3), אדג’ובנט שלם של פרוינד (CFA) ותוספת של Mycobacterium tuberculosis. הזרקה של תחליב צמיג זה על העורף ואחריה הזרקה intraperitoneal יחיד של Bordetella pertussis toxin . עם תחילת הסימפטומים (יום 12-14) ובהרדמה כללית, נלקחות תמונות פונדוסקופיות כדי להעריך את התקדמות המחלה באמצעות בדיקה קלינית. ניתן להשוות נתונים אלה ישירות לאלה בנקודות זמן מאוחרות יותר ובשיא המחלה (יום 20-22) עם ניתוח הבדלים. יחד עם זאת, פרוטוקול זה מאפשר לחוקר להעריך הבדלים פוטנציאליים בחדירות כלי הדם ובנזק באמצעות אנגיוגרפיה פלואורסצאין. EAU יכול להיות מושרה בזני עכברים אחרים – הן פראיים או מהונדסים גנטית – ובשילוב עם טיפולים חדשניים המציעים גמישות לחקר יעילות התרופה ו / או מנגנוני המחלה.
Introduction
פרוטוקול זה ידגים כיצד לגרום לאובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU) בעכבר C57BL/6J על ידי הזרקה תת-עורית יחידה של אנטיגן רשתית באדג’ובנט מתחלב. שיטות לניטור והערכה של התקדמות המחלה יפורטו באמצעות הדמיה פונדוסקופית ובדיקה היסטולוגית, עם פרמטרים למדידה המתוארים בהן. בנוסף, תידון אנגיוגרפיה פלואורסצאין, טכניקה לבחינת מבנה כלי הדם ברשתית וחדירות.
מודל EAU זה משחזר תכונות מרכזיות של אובאיטיס אחורית לא זיהומית בבני אדם ביחס למאפיינים קליניים-אופתולוגיים והמנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים המניעים מחלות. EAU מתווך על ידי תת-קבוצות Th1 ו / או Th17 של לימפוציטים CD4+T תגובתיים עצמיים, כפי שמוצג בניסויי העברה מאומצת ובעכברים מרוקנים IFNγ1. חלק גדול מההבנה שלנו של התפקידים הפוטנציאליים של תאים אלה באובאיטיס מגיע ממחקר EAU2, שבו תאי Th1 ו-Th17 מזוהים בתוך רקמות הרשתית3. לעתים קרובות, EAU משמש כמודל פרה-קליני להערכת התועלת של טיפולים חדשניים בהחלשת המחלה. גישות טיפוליות אשר הצליחו לווסת את מחלת EAU הראו יעילות מסוימת במרפאה והגיעו למעמד מאושר FDA. דוגמאות לכך הן קבוצות של תרופות אימונו-רגולטוריות כגון טיפולים ממוקדי תאי T: ציקלוספורין, FK-506 ורפמיצין 4,5,6. לאחרונה, התערבויות המכוונות למסלולים חדשים נחקרו גם במודל זה כדי לחקור הן את המנגנון והן את ההשפעה על תוצאות המחלה. אלה כוללים מיקוד ויסות שעתוק באמצעות קורא הכרומטין Bromodomain Extra-Terminal חלבונים (BET) ומעכבי P-TEFb3. יתר על כן, גישות קונבנציונליות יותר כגון מעכב VLA-4 הוכיחו לאחרונה דיכוי ב- EAU באמצעות אפנוןשל תאי T CD4+ 7. בנוסף, מיקוד תאי Th17 עם TMP778, אגוניסט הופכי RORγt, נמצא גם כמדכא באופן משמעותי את EAU8. יתר על כן, מודל זה מציע הזדמנות לחקור דלקת אוטואימונית כרונית ברשתית ואת המנגנונים הבסיסיים הנלווים כגון פריימינג לימפוציטים.
הקריאות העיקריות למחקרים פרה-קליניים של EAU הן הערכה קלינית על ידי ביצוע הדמיה פונדוסקופית רשתית ובתדירות נמוכה יותר, על ידי הערכת שלמות הרשתית על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). הערכה היסטופתולוגית של הרשתית ואימונופנוטיפ של תאי הרשתית על ידי ציטומטריית זרימה מתבצעות לאחר מכן בסיום. פונדוסקופיה היא מערכת הדמיה חיה קלה לשימוש המאפשרת הערכה קלינית מהירה וניתנת לשחזור של הרשתית כולה. להערכות אימונוהיסטוכימיות, הטכניקות מבוססות על הכנת קטעי רשתית המאפשרים לנו ללמוד ארכיטקטורת רקמות למידת הדלקת והנזק המבני9. קריטריוני ההערכה ומערכות הניקוד הקונבנציונליות, עבור כל הטכניקות בהן נעשה שימוש, יפורטו במסגרת פרוטוקול זה. היקף הנזק שנרשם באמצעות הדמיה פונדוסקופית נמצא לעתים קרובות בקורלציה הדוקה עם שינויים היסטולוגיים. גישה כפולה זו לניטור והערכת חומרת המחלה מעניקה רגישות רבה יותר ותוצאות מדידה אמינות יותר.
EAU הוא מודל מבוסס היטב ונפוץ לבדיקה פרה-קלינית וחקירה של מחלות עיניים בתיווך מערכת החיסון. מודל זה אמין וניתן לשחזור עם שכיחות מחלה של >95% ומייצר נתונים מקיפים שניתן להשתמש בהם כדי לאמת או לדחות טיפולים חדשים לטיפול במחלה דלקתית תוך עינית המייצגת גורם עיקרי לעיוורון בגיל העבודה ברחבי העולם10.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים ניסיוניים של בעלי חיים הם כלים הכרחיים לחקר פתוגנזה של מחלות ולבדיקה פרה-קלינית של פרדיגמות טיפוליות חדשות. בפרוטוקול הנוכחי, דנו במתודולוגיה להשראת, ניטור וניקוד EAU, מודל ניסיוני של אובאיטיס דלקתית תוך עינית. מודל EAU זה כולל שכיחות מחלה של יותר מ -95% כאשר כל ההליכים מבוצעים על פי הפר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG זכתה במימון UCL Impact Studentship ו-Rosetrees Trust לתמיכה ב-CB. VC קיבלה מענק שיתוף פעולה מחקרי מחברת Akari Therapeutics Inc. ברצוננו להודות למכון UCL לרפואת עיניים, ליחידת השירות הביולוגי ובמיוחד לגב’ אליסון או’הרה ולצוותה על תמיכתם הטכנית.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
