Экспериментальный аутоиммунный увеит: внутриглазная воспалительная модель мыши
Summary
В этом отчете мы представляем протокол, который позволяет исследователю сгенерировать мышиную модель внутриглазного увеита. Эта модель, чаще называемая экспериментальным аутоиммунным увеитом (EAU), охватывает многие аспекты заболеваний человека. Здесь мы опишем, как индуцировать и контролировать прогрессирование заболевания, используя несколько показаний.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU) управляется иммунными клетками, реагирующими на собственные антигены. Многие особенности этой неинфекционной, внутриглазной модели воспалительного заболевания повторяют клинический фенотип заднего увеита, поражающего людей. EAU был надежно использован для изучения эффективности новых воспалительных терапевтических средств, их способа действия и для дальнейшего исследования механизмов, лежащих в основе прогрессирования внутриглазных заболеваний. Здесь мы приводим подробный протокол по индукции EAU у мыши C57BL/6J – наиболее широко используемого модельного организма с восприимчивостью к этому заболеванию. Клиническая оценка тяжести и прогрессирования заболевания будет продемонстрирована с помощью фундоскопии, гистологического исследования и флуоресцеиновой ангиографии. Процедура индукции включает подкожную инъекцию эмульсии, содержащей пептид (IRBP1-20) из глазного белка интерфоторецептора ретиноидового связывающего белка (также известного как ретинолсвязывающий белок 3), complete Freund’s Adjuvant (CFA) и дополненного убитой Mycobacterium tuberculosis. Инъекция этой вязкой эмульсии на заднюю часть шеи сопровождается однократной внутрибрюшинной инъекцией токсина Bordetella pertussis . При появлении симптомов (12-14 день) и под общим наркозом делаются фундоскопические снимки для оценки прогрессирования заболевания путем клинического обследования. Эти данные можно напрямую сравнить с данными в более поздние моменты времени и пик заболевания (день 20-22) с проанализированными различиями. В то же время этот протокол позволяет исследователю оценить потенциальные различия в проницаемости сосудов и повреждениях с помощью флуоресцеиновой ангиографии. EAU может быть индуцирован у других штаммов мышей – как дикого типа, так и генетически модифицированных – и в сочетании с новыми методами лечения, обеспечивающими гибкость для изучения эффективности лекарств и / или механизмов заболевания.
Introduction
Этот протокол продемонстрирует, как индуцировать экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU) у мыши C57BL/6J путем однократной подкожной инъекции антигена сетчатки в эмульгированном адъюванте. Методы мониторинга и оценки прогрессирования заболевания будут детализированы с помощью фандоскопической визуализации и гистологического исследования с изложенными в них параметрами измерения. Кроме того, будет обсуждаться флуоресцеиновая ангиография, методика исследования структуры кровеносных сосудов сетчатки и проницаемости.
Эта модель EAU резюмирует центральные особенности неинфекционного заднего увеита у людей в отношении клиникопатологических характеристик и основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют заболеванием. EAU опосредована подмножествами Th1 и/или Th17 самореактивных CD4+T-лимфоцитов, как показано в экспериментах по переносу усыновления и у мышей, обедненных IFNγ1. Большая часть нашего понимания потенциальной роли этих клеток при увеите исходит из изучения EAU2, где клетки Th1 и Th17 обнаруживаются в тканях сетчатки3. Часто EAU используется в качестве доклинической модели для оценки полезности новых методов лечения в ослаблении заболевания. Терапевтические подходы, которые успешно модулировали болезнь EAU, показали некоторую эффективность в клинике и достигли статуса одобренного FDA. Примерами этого являются группы иммунорегуляторных препаратов, таких как Т-клеточная таргетная терапия: циклоспорин, FK-506 и рапамицин 4,5,6. В последнее время в этой модели также были изучены вмешательства, нацеленные на новые пути, для изучения как механизма, так и влияния на исход заболевания. К ним относятся нацеливание транскрипционной регуляции через считыватель хроматина Bromodomain Extra-Terminal (BET) белки и ингибиторы P-TEFb3. Более того, более традиционные подходы, такие как ингибитор VLA-4, недавно продемонстрировали подавление в EAU посредством модуляции эффекторных CD4 + Т-клеток7. Кроме того, было обнаружено, что нацеливание на клетки Th17 с помощью TMP778, обратного агониста RORγt, значительно подавляет EAU8. Кроме того, эта модель дает возможность изучить хроническое аутоиммунное воспаление в сетчатке и сопутствующие основные механизмы, такие как прайминг лимфоцитов.
Основными показаниями для доклинических исследований EAU являются клиническая оценка путем выполнения визуализации фундоскопии сетчатки и реже путем оценки целостности сетчатки с помощью оптической когерентной томографии (OCT). Гистопатологическая оценка сетчатки и иммунофенотипирование клеток сетчатки методом проточной цитометрии затем проводятся при прекращении. Фундоскопия – это простая в использовании живая система визуализации, которая позволяет быстро и воспроизводимо проводить клиническую оценку всей сетчатки. Для иммуногистохимических оценок методики основаны на подготовке срезов сетчатки, которые позволяют изучать архитектуру тканей на степень воспаления и структурного повреждения9. Критерии оценки и традиционные системы оценки для всех используемых методов будут изложены в рамках этого протокола. Степень повреждения, регистрируемого с помощью фандоскопической визуализации, часто тесно коррелирует с гистологическими изменениями. Этот двойной подход к мониторингу и оценке тяжести заболевания обеспечивает большую чувствительность и более надежные результаты измерения.
EAU является хорошо зарекомендовавшей себя, широко используемой моделью для доклинического тестирования и исследования иммуноопосредованных заболеваний глаз. Эта модель надежна и воспроизводима с >95% заболеваемости и генерирует всеобъемлющие данные, которые могут быть использованы для проверки или отказа от новых методов лечения внутриглазного воспалительного заболевания, которое представляет собой основную причину слепоты трудоспособного возраста во всем мире10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные модели на животных являются необходимыми инструментами для изучения патогенеза заболеваний и доклинического тестирования новых терапевтических парадигм. В текущем протоколе мы обсудили методологию индуцирования, мониторинга и оценки EAU, экспериментальной модели …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG была награждена финансированием UCL Impact Studentship и Rosetrees Trust для поддержки CB. VC получил грант на совместную исследовательскую деятельность от Akari Therapeutics Inc. Мы хотели бы поблагодарить Институт офтальмологии UCL, подразделение биологической службы, особенно г-жу Элисон О’Хара и ее команду за их техническую поддержку.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
