실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델
Summary
이 보고서에서 우리는 조사자가 안내 포도막염의 마우스 모델을 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 더 일반적으로 실험적 자가면역 포도막염(EAU)이라고 하는 이 확립된 모델은 인간 질병의 여러 측면을 포착합니다. 여기에서는 여러 판독값을 사용하여 질병 진행을 유도하고 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
실험적 자가면역 포도막염(EAU)은 자가 항원에 반응하는 면역 세포에 의해 유발됩니다. 이 비 전염성, 안내 염증 질환 모델의 많은 특징은 인간에게 영향을 미치는 후 포도막염의 임상 표현형을 요약합니다. EAU는 새로운 염증 치료제의 효능, 작용 방식을 연구하고 안내 질환의 질병 진행을 뒷받침하는 메커니즘을 추가로 조사하는 데 안정적으로 사용되었습니다. 여기에서는 이 질병에 취약한 가장 널리 사용되는 모델 유기체인 C57BL/6J 마우스의 EAU 유도에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 질병 중증도 및 진행의 임상 적 평가는 안저 내시경 검사, 조직 학적 검사 및 fluorescein 혈관 조영술을 사용하여 입증됩니다. 유도 절차는 안구 단백질 광수용체 레티노이드 결합 단백질(레티놀 결합 단백질 3이라고도 함), 완전 프로인트 보조제(CFA)로부터 펩티드(IRBP1-20)를 함유하는 에멀젼을 피하 주사하고 사멸된 결핵균을 보충하는 것을 포함합니다 . 이 점성 에멀젼을 목 뒤쪽에 주사 한 다음 Bordetella 백일해 독소를 복강 내 주사합니다. 증상이 시작될 때(12-14일) 전신 마취 상태에서 임상 검사를 통해 질병 진행을 평가하기 위해 안저경 이미지를 촬영합니다. 이러한 데이터는 차이를 분석하여 후기 시점 및 피크 질병 (20-22 일)의 데이터와 직접 비교할 수 있습니다. 동시에,이 프로토콜을 통해 조사자는 fluorescein 혈관 조영술을 사용하여 혈관 투과성 및 손상의 잠재적 차이를 평가할 수 있습니다. EAU는 야생형 또는 유전자 변형 된 다른 마우스 균주에서 유도 될 수 있으며 약물 효능 및 / 또는 질병 메커니즘을 연구하기위한 유연성을 제공하는 새로운 치료법과 결합 될 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜은 유화된 보조제에 망막 항원을 단일 피하 주사하여 C57BL/6J 마우스에서 실험적 자가면역 포도막염(EAU)을 유도하는 방법을 보여줍니다. 질병 진행을 모니터링하고 평가하는 방법은 안저 내시경 영상 및 조직 검사를 통해 자세히 설명되며 측정 매개 변수가 요약되어 있습니다. 또한, 망막 혈관 구조 및 투과성을 검사하는 기술인 플루오레세인 혈관조영술에 대해서도 논의할 것이다.
이 EAU 모델은 임상 병리학 적 특성과 질병을 유발하는 기본 세포 및 분자 메커니즘과 관련하여 인간의 비 감염성 후방 포도막염의 중심 특징을 요약합니다. EAU는 입양 이식 실험 및 IFNγ-고갈 마우스1에서 나타낸 바와 같이, 자가 반응성 CD4+T 림프구의 Th1 및/또는 Th17 서브세트에 의해 매개된다. 포도막염에서 이러한 세포의 잠재적 역할에 대한 우리의 이해의 대부분은 망막 조직 내에서 Th1 및 Th17 세포가 모두 검출되는 EAU2를 연구하는 데서 비롯됩니다3. 종종 EAU는 질병을 약화시키는 새로운 치료법의 유용성을 평가하기위한 전임상 모델로 사용됩니다. EAU 질병을 성공적으로 조절한 치료 접근법은 클리닉에서 일부 효능을 보였고 FDA 승인 상태에 도달했습니다. 이들의 예는 T 세포 표적화 요법과 같은 면역조절 약물의 그룹이다: 사이클로스포린, FK-506, 및 라파마이신 4,5,6. 최근에는 질병 결과에 대한 메커니즘과 효과를 모두 조사하기 위해이 모델에서 새로운 경로를 목표로하는 중재도 탐구되었습니다. 여기에는 염색질 판독기 브로모도메인 엑스트라 말단(BET) 단백질 및 P-TEFb 억제제3를 통한 전사 조절을 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 더욱이, VLA-4 억제제와 같은 보다 통상적인 접근법은 최근 이펙터 CD4+ T 세포7의 조절을 통해 EAU에서 억제를 입증하였다. 또한, RORγt 역작용제인 TMP778로 Th17 세포를 표적화하는 것도 EAU8을 유의하게 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 모델은 망막의 만성 자가면역 염증 및 림프구 프라이밍과 같은 수반되는 기본 메커니즘을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.
EAU 전임상 연구의 주요 판독은 망막 안저경 영상을 수행하여 임상 평가하고 덜 자주 광학 간섭 단층 촬영(OCT)으로 망막 무결성을 평가하는 것입니다. 유세포 분석에 의한 망막 조직 병리학 적 평가 및 망막 세포의 면역 표현형은 종결시 수행됩니다. Fundoscopy는 전체 망막의 신속하고 재현 가능한 임상 평가를 가능하게하는 사용하기 쉬운 라이브 이미징 시스템입니다. 면역 조직 화학적 평가의 경우,이 기술은 염증 및 구조적 손상 정도에 대한 조직 구조를 연구 할 수있는 망막 절편의 준비를 기반으로합니다9. 사용 된 모든 기술에 대한 평가 기준 및 기존 채점 시스템은이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 안저 영상을 사용하여 기록 된 손상 정도는 종종 조직 학적 변화와 밀접한 관련이 있습니다. 질병 중증도를 모니터링하고 평가하는 이러한 이중 접근 방식은 더 높은 감도와 더 신뢰할 수 있는 측정 결과를 제공합니다.
EAU는 면역 매개 안 질환의 전임상 테스트 및 조사를 위해 잘 확립되고 일반적으로 사용되는 모델입니다. 이 모델은 >95%의 질병 발생률로 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 전 세계적으로 근로 연령 실명의 주요 원인을 나타내는 안구 내 염증성 질환 치료를 위한 새로운 치료법을 검증하거나 거부하는 데 사용할 수 있는 포괄적인 데이터를 생성합니다10.
Protocol
Representative Results
Discussion
실험 동물 모델은 질병 발병기전을 연구하고 새로운 치료 패러다임의 전임상 테스트를 수행하는 데 필요한 도구입니다. 현재 프로토콜에서는 안내 염증성 포도막염의 실험 모델 인 EAU를 유도, 모니터링 및 채점하는 방법론에 대해 논의했습니다. 이 EAU 모델은 모든 절차가 본원에 요약된 프로토콜에 따라 수행될 때 95% 이상의 질병 발생률을 가지며, 만성, 단상 EAU의 발달을 초래한다. 이 발병 수준?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG는 CB를 지원하기 위해 UCL Impact Studentship 및 Rosetrees Trust 기금을 수여 받았습니다. VC는 Akari Therapeutics Inc.로부터 연구 협력 보조금을 받았습니다. UCL 안과 연구소, 생물 서비스 부서, 특히 앨리슨 오하라 (Alison O’Hara)와 그녀의 팀의 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
