Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis
Summary
Hier beschreiben wir Methoden für effiziente Puppen- und Erwachseneninjektionen in Nasonia vitripennis als zugängliche Alternativen zur Embryo-Mikroinjektion, die eine funktionelle Analyse von Genen von Interesse entweder mit RNA-Silencing über RNA-Interferenz (RNAi) oder Gen-Knockout durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing ermöglichen.
Abstract
Die Juwelenwespe Nasonia vitripennisist zu einem effizienten Modellsystem geworden, um die Epigenetik der haplo-diploiden Geschlechtsbestimmung, der B-Chromosom-Biologie, der Wirt-Symbionten-Interaktionen, der Artbildung und der Giftsynthese zu untersuchen. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer molekularer Werkzeuge, einschließlich CRISPR/Cas9, sind funktionelle genetische Studien in diesem Organismus immer noch begrenzt. Die Haupteinschränkung bei der Anwendung der CRISPR/Cas9-Technologie bei N. vitripennis ergibt sich aus den Herausforderungen embryonaler Mikroinjektionen. Injektionen von Embryonen sind in diesem Organismus und im Allgemeinen bei vielen parasitoiden Wespen aufgrund der geringen Embryogröße und der Notwendigkeit einer Wirtspuppe für die Embryonalentwicklung besonders schwierig. Um diese Herausforderungen anzugehen, wurde die Abgabe des Cas9-Ribonukleoproteinkomplexes in die weiblichen Eierstöcke durch Injektion durch Erwachsene anstelle einer embryonalen Mikroinjektion optimiert, was sowohl zu somatischen als auch zu vererbbaren Keimbahnbearbeitungen führte. Die Injektionsverfahren wurden bei Puppen und weiblichen Wespen entweder mit ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) oder BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) optimiert. Diese Methoden haben sich als wirksame Alternativen zur Embryoinjektion erwiesen und ermöglichen ortsspezifische und vererbbare Keimbahnmutationen.
Introduction
CRISPR/Cas9 Gen-Editing ist eine leistungsfähige Technologie für funktionelle genetische Studien, insbesondere in vielen aufstrebenden Modellorganismen wie der Juwelenwespe, Nasonia vitripennis. Die einfache Aufzucht und die Verfügbarkeit eines vollständigen Genoms machen die Juwelenweipe zu einem wichtigen experimentellen System, um die molekularen Mechanismen verschiedener biologischer Prozesse aufklärt. Zum Beispiel wurde N. vitripennis kürzlich verwendet, um die epigenetische Grundlage des haplodiploiden Geschlechtsbestimmungssystems1,2, die Biologie der B-Chromosomen 3 ,4,5,6und die genetische Grundlage für die zirkadiane und saisonale Regulation7,8zu entschlüsseln. Einige der Merkmale, die N. vitripennis für die Arbeit nutzbar machen, sind kurze Generationszeit (~ 2 Wochen bei 25 ° C), hohe Reproduktionsraten, einfache Geschlechtstrennung im Puppenstadium und die Fähigkeit, Stämme bei 4 ° C zu diapausen und zu speichern. Der Lebenszyklus beginnt damit, dass weibliche Wespen die Puppen der Blasfly, Sarcophaga bullata,parasitieren. Durch ihren Ovipositor legen weibchen bis zu 50 Eier in den Puppenkasten der Blasfly. Eier entwickeln sich zu Larven, die sich von der S. bullata-Puppe ernähren, sich in den nächsten Tagen weiter entwickeln und sich dann verpuppen, gefolgt von einer erwachsenen Eklosion und dem Auftauchen aus dem Wirtspuparium9.
Molekulare Werkzeuge zur Durchführung funktioneller genetischer Studien in N. vitripennis, wie RNA-Interferenz (RNAi)10 und CRISPR / Cas911,12, sind verfügbar, sind aber begrenzt, vor allem aufgrund von Schwierigkeiten bei der Durchführung embryonaler Mikroinjektionen13. Da N. vitripennis-Eier für die Entwicklung einen Puppenwirt benötigen, ist die Eimanipulation sehr schwierig. Embryonen im Stadium vor dem Blastoderm müssen von den Wirtsblasfliegenpuppen entnommen, schnell mikroinjektiert und sofort zur Entwicklung zurück an den Wirt übertragen werden13. Diese Schritte erfordern Präzision und spezielles Training, um zu vermeiden, dass die mikroinjektierten Embryonen oder die Puppenwirte beschädigt werden13. Darüber hinaus sind die Eier sehr klein und zerbrechlich, insbesondere nach Mikroinjektionen, mit einem sehr viskosen Zytoplasma, das eine kontinuierliche Verstopfung der Injektionsnadel verursacht13. Diese Eigenschaften machen embryonale Mikroinjektionen außergewöhnlich herausfordernd und erfordern hochqualifizierte Bediener und spezielle Geräte, die in den meisten N. vitripennis-Labors fehlen.
Die Optimierung alternativer Injektionsmethoden zur Abgabe von CRISPR-Reagenzien würde zur Festigung von N. vitripennis als Modellorganismus beitragen. Die Manipulation von Puppen und Erwachsenen ist weniger herausfordernd als die Manipulation von Embryonen und kann mit einem grundlegenden Injektionsaufbau erreicht werden. Hier werden zwei Protokolle für die Injektion von Puppen und Erwachsenen beschrieben: eines mit spezialisierten Geräten für Injektionen und das andere mit der Verwendung einer Absaugrohranordnung, die mit einer Glaskapillarnadel ausgestattet ist. Die Verwendung eines Absaugrohrs eignet sich besonders für Laboratorien, die keinen Zugang zu speziellen Geräten für Embryo-Mikroinjektionen haben. Effiziente Injektionen verschiedener Entwicklungsstadien von N. vitripennis, einschließlich weißer oder schwarzer Puppen und erwachsener Wespen, werden nachgewiesen. Wespen im Stadium der weißen Puppen eignen sich besonders für RNAi-vermittelte Knockdown-Experimente. Obwohl RNAi in Nasonia erstmals 2006 von Lynch und Desplan beschrieben wurde10,gibt es kein visuelles Verfahren für die Durchführung von RNAi-Injektionen. RNAi wurde kürzlich verwendet, um das Haploidizer-Gen des B-Chromosoms PSR (Paternal Sex Ratio)3 zu entdecken und die Beteiligung des Uhrengens Periodean den biologischen Rhythmen von N. vitripennis zu untersuchen 7.
Schwarze Puppen und erwachsene Wespen können verwendet werden, um crispR / Cas9-Keimbahn-Gen-Editing mit ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) und BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) Protokollen zu induzieren. Diese beiden Ovarialabgabemethoden wurden kürzlich als wirksam bei Nasonia beschrieben, um Keimbahnmutationen im Zielgen, Zinnober7,12,zu erzeugen. Hier wird ein vereinfachtes Protokoll für Injektionen bereitgestellt, einschließlich eines visuellen Verfahrens einer Schritt-für-Schritt-Methodik für Puppen- und Erwachseneninjektionen, die verwendet werden kann, um funktionelle genetische Studien in Nasonia und wahrscheinlich in anderen parasitoiden Wespen zu generieren, ohne dass spezielle Ausrüstung erforderlich ist und embryonale Mikroinjektionen umgangen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der kürzlich verstärkten Verwendung von Nasonia vitripennis als Modellorganismus für verschiedene biologische Fragen2,3,7,17besteht die Notwendigkeit, Injektionsmethoden zu entwickeln und zu optimieren, um ein vereinfachtes und effizientes Protokoll für die funktionelle Analyse von N. vitripennis-Genen zu ermöglichen. Die derzeitigen Methoden zur embryonalen Mikroinje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch UCSD-Startup-Fonds unterstützt, die an O.S.A. und NSF / BIO-Zuschüsse 1645331 an J.L.R. gerichtet waren.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
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