Инъекции куколки и взрослых для редактирования генов РНКи и CRISPR в Nasonia vitripennis
Summary
Здесь мы описываем методы эффективных инъекций куколок и взрослых в Nasonia vitripennis как доступные альтернативы микроинъекции эмбриона, позволяющие проводить функциональный анализ генов, представляющих интерес, с использованием либо ГЛУШЕНИЯ РНК через РНК-интерференцию (РНКи), либо нокаута гена с помощью редактирования генома CRISPR / Cas9.
Abstract
Ювелирная сова, Nasonia vitripennis,стала эффективной модельной системой для изучения эпигенетики гапло-диплоидного определения пола, биологии В-хромосомы, взаимодействий хозяин-симбионт, видообразования и синтеза яда. Несмотря на наличие нескольких молекулярных инструментов, включая CRISPR / Cas9, функциональные генетические исследования все еще ограничены в этом организме. Основное ограничение применения технологии CRISPR/Cas9 в N. vitripennis связано с проблемами эмбриональных микроинъекций. Инъекции эмбрионов особенно сложны в этом организме и в целом у многих паразитоидных ос из-за небольшого размера эмбриона и потребности куколки хозяина для эмбрионального развития. Для решения этих проблем была оптимизирована доставка комплекса рибонуклеопротеинов Cas9 в женские яичники путем инъекции взрослым, а не эмбриональной микроинъекции, что привело как к соматическим, так и к наследственным изменениям зародышевой линии. Процедуры инъекций были оптимизированы для куколок и самок ос с использованием ReMOT Control (рецепторно-опосредованная яичниковая трансдукция груза) или BAPC (разветвленные амфифильные пептидные капсулы). Показано, что эти методы являются эффективными альтернативами инъекции эмбриона, позволяющими создавать специфические для сайта и на наследственные мутации зародышевой линии.
Introduction
Редактирование генов CRISPR/Cas9 является мощной технологией для функциональных генетических исследований, особенно во многих растущих модельных организмах, таких как ювелирная ось, Nasonia vitripennis. Легкость выращивания и наличие полного генома делает ювелирную ось важной экспериментальной системой для выяснения молекулярных механизмов различных биологических процессов. Например, N. vitripennis недавно был использован для разгадки эпигенетических основ гаплодиплоидной системы определения пола1,2,биологии В-хромосом3,4,5,6и генетической основы циркадной и сезонной регуляции7,8. Некоторые из особенностей, которые делают N. vitripennis поддается работе, включают короткое время генерации (~ 2 недели при 25 ° C), высокие темпы размножения, легкое разделение пола на стадии куколки и способность к диапаузе и хранению штаммов при 4 ° C. Жизненный цикл начинается с того, что самки ос паразитируют на куколках летуча, Sarcophaga bullata. Через свой яйцеклад самки откладывают до 50 яиц в случае куколки летухи. Яйца развиваются в личинок, которые питаются куколками S. bullata, продолжают развиваться в течение следующих нескольких дней, а затем окукливаются, после чего происходит взрослая эклозия и появление из хозяина puparium9.
Молекулярные инструменты для выполнения функциональных генетических исследований у N. vitripennis,такие как РНК-интерференция(РНКи) 10 и CRISPR/Cas911,12,имеются, но ограничены, в первую очередь из-за трудностей в выполнении эмбриональных микроинъекций13. Поскольку яйца N. vitripennis требуют хозяина куколки для развития, манипуляции с яйцами очень сложны. Эмбрионы предструстодельной стадии должны быть собраны из куколок вмастерской летучки, быстро микроинъектированы и немедленно перенесены обратно хозяину для развития13. Эти шаги требуют точности и специализированной подготовки, чтобы избежать повреждения микроинъекций эмбрионов или хозяев куколки13. Кроме того, яйца очень маленькие и хрупкие, особенно после микроинъекций, с очень вязкой цитоплазмой, вызывающей непрерывное засорение инъекционной иглы13. Эти особенности делают эмбриональные микроинъекции исключительно сложными, требуя высококвалифицированных операторов и специализированного оборудования, которое отсутствует в большинстве лабораторий N. vitripennis.
Оптимизация альтернативных методов впрыска для доставки реагентов CRISPR будет способствовать консолидации N. vitripennis в качестве модельного организма. Манипуляции с куколками и взрослыми особями менее сложны, чем манипулирование эмбрионами, и могут быть выполнены с помощью базовой инъекционной установки. Здесь описаны два протокола для инъекций куколок и взрослых: один включает специализированное оборудование для инъекций, а другой включает использование аспираторной трубки в сборе, оснащенной стеклянной капиллярной иглой. Использование аспираторной трубки особенно подходит для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированной технике для микроинъекций эмбрионов. Продемонстрированы эффективные инъекции различных стадий развития N. vitripennis,включая белых или черных куколок и взрослых ос. Осы на стадии белой куколки особенно подходят для экспериментов с нокдаунами, опосредованных РНКи. Хотя РНКи в Насонии был впервые описан Линчем и Деспаном в 2006году10,нет никакой визуальной процедуры, доступной для того, как выполняются инъекции РНКи. РНКи был недавно использован для открытия гена гаплоидизатора В-хромосомы PSR (Отцовское соотношение полов)3 и для изучения участия часового гена, периода,в биологических ритмах N. vitripennis 7.
Черные куколки и взрослые осы могут быть использованы для индуцирования редактирования генов зародышевой линии CRISPR / Cas9 с использованием протоколов ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) и BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Эти два метода доставки яичники были недавно описаны как эффективные в Насонии для генерации мутаций зародышевой линии в гене-мишени, киновари7,12. Здесь для инъекций предусмотрен упрощенный протокол, включающий визуальную процедуру пошаговой методологии как для куколок, так и для взрослых инъекций, которая может быть использована для проведения исследований функциональной генетики в Насонии и, вероятно, у других паразитоидных ос, не требуя специализированного оборудования и обходя эмбриональные микроинъекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В связи с недавним увеличением использования Nasonia vitripennis в качестве модельного организма для различных биологических вопросов2,3,7,17возникла необходимость в разработке и оптимизации методов инъекций для обеспеч…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана стартовыми фондами UCSD, направленными в O.S.A. и грантом NSF / BIO 1645331 J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
