Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları
Summary
Burada, Nasonia vitripennis’te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.
Abstract
Mücevher eşekarısı, Nasonia vitripennis, haplo-diploid cinsiyet tayini, B kromozomu biyolojisi, konak-symbiont etkileşimleri, speciation ve zehir sentezinin epigenetiklerini incelemek için verimli bir model sistemi haline gelmiştir. CRISPR/Cas9 da dahil olmak üzere çeşitli moleküler araçların mevcudiyetine rağmen, fonksiyonel genetik çalışmalar bu organizmada hala sınırlıdır. CRISPR/Cas9 teknolojisinin N. vitripennis’te uygulanmasının başlıca sınırlaması embriyonik mikroenjeksiyonların zorluklarından kaynaklanmaktadır. Embriyo enjeksiyonları, küçük embriyo büyüklüğü ve embriyonik gelişim için konak pupa gereksinimi nedeniyle, bu organizmada ve genel olarak birçok parazitoid eşekarısında özellikle zordur. Bu zorlukları ele almak için Cas9 ribonikleoprotein, embriyonik mikroenjeksiyon yerine yetişkin enjeksiyonu ile kadın yumurtalıklarına karmaşık doğum optimize edildi ve bu da hem somatik hem de kalıtsal germline düzenlemelerine neden oldu. Enjeksiyon prosedürleri, ReMOT Kontrolü (Reseptör Aracılı Yük Transdüksiyonu) veya BAPC (Dallı Amfifilik Peptit Kapsülleri) kullanılarak pupa ve dişi eşekarısında optimize edildi. Bu yöntemlerin embriyo enjeksiyonuna etkili alternatifler olduğu, bölgeye özgü ve kalıtsal germline mutasyonlarına olanak sağladığı gösterilmiştir.
Introduction
CRISPR / Cas9 gen düzenleme, özellikle mücevher yabanatı, Nasonia vitripennisgibi birçok yükselen model organizmada fonksiyonel genetik çalışmalar için güçlü bir teknolojidir. Yetiştirme kolaylığı ve tam bir genomun mevcudiyeti, mücevher yaban arısını farklı biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmalarını aydınlatan önemli bir deneysel sistem haline getirir. Örneğin, N. vitripennis son zamanlarda haplodiploid cinsiyet belirleme sisteminin epigenetik temelini çözmek için kullanılmıştır1,2, B kromozomlarının biyolojisi3,4,5,6ve sirkadiyen ve mevsimsel düzenlemenin genetik temeli7,8. N. vitripennis’i çalışmaya elverişli kılan özelliklerden bazıları arasında kısa nesil süre (~2 hafta 25 °C), yüksek üreme oranları, pupal aşamasında kolay cinsiyet ayrımı ve suşları 4 °C’de diapause ve depolama yeteneği bulunur. Yaşam döngüsü, dişi eşekarısının blowfly, Lahit bullata’nınpupalarını parazitleştirmesiyle başlar. Ovipozitörleri aracılığıyla dişiler, üfleme üflemeli pupal durumunda 50’ye kadar yumurta bırakırlar. Yumurtalar S. bullata pupa ile beslenen larvalara dönüşür, önümüzdeki birkaç gün boyunca gelişmeye devam eder ve daha sonra yavrular, ardından yetişkin eklozyonu ve konak puparium9’danortaya çıkar.
RNA girişim (RNAi) 10 ve CRISPR/Cas9 11,12 gibi N. vitripennis’tefonksiyonel genetik çalışmalar yapmak için moleküler araçlar mevcuttur, ancak öncelikle embriyonik mikroenjections13′ün gerçekleştirilmesinde zorluklar nedeniyle sınırlıdır. N. vitripennis yumurtaları gelişim için bir pupal konak gerektirdiği için yumurta manipülasyonu çok zordur. Pre-blastoderm evre embriyoları konak üflemeli pupalardan toplanmalı, hızlı bir şekilde mikroenjeze edilmeli ve hemen geliştirme için ana bilgisayara geri aktarılmalıdır13. Bu adımlar, mikroenjected embriyolara veya pupal konaklarına zarar vermemek için hassas ve özel eğitim gerektirir13. Dahası, yumurtalar çok küçük ve kırılgandır, özellikle mikroenjections sonra, enjekte iğnesinin sürekli tıkanması neden olan çok viskoz bir sitoplazmaile 13. Bu özellikler embriyonik mikroenjections son derece zorlu hale getirir, yüksek eğitimli operatörler ve çoğu N. vitripennis laboratuvarlarında bulunmayan özel ekipman gerektirir.
CRISPR reaktiflerinin teslimi için alternatif enjeksiyon yöntemlerinin optimizasyonu, N. vitripennis’in bir model organizma olarak birleştirilmesine katkıda bulunacaktır. Pupaların ve yetişkinlerin manipülasyonu embriyoları manipüle etmekten daha az zordur ve temel bir enjeksiyon kurulumu ile gerçekleştirilebilir. Burada, pupa ve yetişkinlerin enjeksiyonu için iki protokol tanımlanmıştır: biri enjeksiyonlar için özel ekipman içeren, diğeri ise cam kılcal iğne ile donatılmış bir aspiratör tüp tertibatının kullanımını içeren. Aspiratör tüpünün kullanımı özellikle embriyo mikroenjections için özel ekipmana erişimi olmayan laboratuvarlar için uygundur. Beyaz veya siyah pupalar ve yetişkin eşekarısı da dahil olmak üzere N. vitripennis’infarklı gelişim aşamalarının verimli enjeksiyonları gösterilmiştir. Beyaz pupal aşamasındaki eşekarısı özellikle RNAi aracılı nakavt deneyleri için uygundur. Nasonia’daki RNAi ilk olarak Lynch ve Desplan tarafından 200610’datanımlanmış olmasına rağmen, RNAi enjeksiyonlarının nasıl yapıldığına dair görsel bir prosedür yoktur. RNAi son zamanlarda B kromozomu PSR (Paternal Sex Ratio)3’ün haploidizer genini keşfetmek ve saat geninin tutulumunun incelenmesi için kullanıldı, nokta, N. vitripennis biyolojik ritimlerinde7.
Siyah pupa ve yetişkin eşekarısı, ReMOT Kontrolü (Reseptör Aracılı Kargo Transdüksiyonu) ve BAPC (Dallı Amfifilik Peptit Kapsülleri) protokollerini kullanarak CRISPR/Cas9 germline gen düzenlemesini teşvik etmek için kullanılabilir. Bu iki yumurtalık doğum yönteminin son zamanlarda Nasonia’da hedef gende germline mutasyonları üretmek için etkili olduğu tanımlanmıştır, cinnabar7,12. Burada, nasonia’da ve muhtemelen diğer parazitoid eşekarısılarda fonksiyonel genetik çalışmalar üretmek için kullanılabilecek hem pupal hem de yetişkin enjeksiyonları için, özel ekipman gerektirmeden ve embriyonik mikroenjeksiyonları atlayarak adım adım bir metodolojinin görsel prosedürünü içeren enjeksiyonlar için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nasonia vitripennis’in çeşitli biyolojik sorular için model organizma olarak son zamanlarda artan kullanımı ile2,3,7,17, N. vitripennis genlerinin fonksiyonel analizi için basitleştirilmiş ve verimli bir protokol sağlamak için enjeksiyon yöntemlerinin geliştirilmesine ve optimize edilmesine ihtiyaç vardır. Gen düzenleme reaktiflerinin embriyonik mikroenjeksiyon?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen O.S.A.’ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları ve J.L.R.’a 1645331 NSF/BIO hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
