ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射
Summary
ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。
Abstract
ジュエルスズメ バチ、ナソーニアビトリペンニスは、ハプロ-ジプロイド性決定、B染色体生物学、宿主共生相互作用、種分化、および毒合成のエピジェネティクスを研究するための効率的なモデルシステムとなっています。CRISPR/Cas9を含むいくつかの分子ツールが利用可能であるにもかかわらず、機能的遺伝学的研究はこの生物において依然として限られている。 N.ビトリペニス にCRISPR/Cas9技術を適用する主な制限は、胚性マイクロインジェクションの課題に起因する。胚の注射は、この生物では特に困難であり、一般的には多くの寄生虫スズメバチでは、小さな胚の大きさと胚発生のための宿主の子犬の要件のために困難である。これらの課題に対処するために、胚性マイクロインジェクションではなく、成人注射による女性卵巣へのCas9リボヌクレオプロテイン複合体の送達が最適化され、体細胞性および遺伝性生殖細胞系列の両方の編集が得られた。注射手順は、ReMOTコントロール(受容体媒介性貨物の卵巣伝達)またはBAPC(分岐性両親媒性ペプチドカプセル)のいずれかを使用して、子犬および雌のスズメバチで最適化されました。これらの方法は、胚注射に有効な代替手段であることが示されており、部位特異的および遺伝性生殖細胞系列突然変異を可能にする。
Introduction
CRISPR/Cas9遺伝子編集は、特にジュエルスズメバチ、ナソニアビトリペンシスなどの多くの上昇モデル生物において、機能的な遺伝学的研究のための強力な技術です。完全なゲノムの入手性と飼育の容易性により、さまざまな生物学的プロセスの分子機構を解明する重要な実験システムとして、宝石のスズイを作ります。例えば、N.ビトリペンシスは最近、ハプロディプロイド性決定系1、2、B染色体3、4、5、6の生物学、概日および季節的な調節7、8の遺伝的基盤のエピジェネティックな基礎を解明するために使用されている。N.ビトリペンニスを使いこなせる機能には、短い世代の時間(25°Cで約2週間)、再生率が高く、パパルステージでの容易な性分離、および4°Cで緊張をジアポーズして保存する機能などがあります。 ライフサイクルは、ブロウフライ、サルコパガ・ブッラタの子犬を寄生する雌のスズメバチから始まります。彼らのオビポジターを介して、メスはブローフライのプパルケースに最大50個の卵を産む。卵は、S.ブラタの子犬を食べる幼虫に発達し、次の数日間にわたって発達し続け、次いで、宿主の子犬9からの成人の飛散および出現を続ける。
N.ビトリペンシスにおいて機能遺伝学的研究を行う分子ツールは、RNA干渉(RNAi)10およびCRISPR/Cas9 11、12など、利用可能であるが、限定的であるが、主に胚性マイクロインジェクション13を行う上で困難なためである。N.ビトリペンニスの卵は開発のためにプパルホストを必要とするので、卵操作は非常に困難です。プレブラトデドムステージ胚は、宿主のブローフライの子犬から採取し、迅速にマイクロインジェクションし、すぐに開発13のために宿主に戻さなければならない。これらのステップは、マイクロ注入胚またはプパルホスト13を損傷することを避けるために、精度と専門的な訓練を必要とします。また、卵は非常に小さく、壊れやすい、特にマイクロインジェクションの後、非常に粘性の細胞質が注射針13の連続的な詰まりを引き起こす。これらの機能は、胚性マイクロインジェクションを非常に困難にし、ほとんどのN.ビトリペニス研究所に存在しない高度な訓練を受けたオペレータと特殊な機器を必要とします。
CRISPR試薬の送達のための代替注入方法の最適化は、モデル生物としてのN.ビトリペンシスの統合に寄与するであろう。子犬と大人の操作は、胚を操作するよりも難しくなく、基本的な注射のセットアップで達成することができます。ここでは、2つのプロトコルは、子犬と成人の注射のために記述されている:注射のための特殊な機器を含む1つと、ガラス毛細血管針を装着したアスピレーターチューブアセンブリの使用を含む他。アスピレーターチューブの使用は、胚マイクロインジェクションのための特殊な機器へのアクセスを持たない実験室に特に適しています。白または黒の子犬および成人のスズメバチを含むN.ビトリペンシスの異なる発達段階の効率的な注射が実証されている。白いプパルの段階でのスズメバチはRNAi媒介性のノックダウン実験に特に適している。ナソーニアのRNAiは2006年10年にリンチとデスプランによって最初に説明されましたが、RNAi注射がどのように行われるかについて利用可能な視覚的な手順はありません。RNAiは最近、B染色体PSR(父性比)3のハプロイダイザー遺伝子を発見し、N.ヴィトリペンシス生物学的リズムにおけるクロック遺伝子の関与を研究するために用いた。
黒い子犬および成体のスズメバチは、ReMOT制御(貨物の受容体媒介性卵巣転移)およびBAPC(分岐性両親媒性ペプチドカプセル)プロトコルを使用してCRISPR/Cas9生殖細胞系列遺伝子編集を誘導するために使用することができる。これら2つの卵巣送達方法は、標的遺伝子において生殖細胞系列変異を発生させるナソニアにおいて有効であると最近説明されている、シナバー7、12。ここでは、ナソニアおよび他の寄生虫スズメバチで機能的遺伝学研究を生成するために利用できるパパルおよび成人注射のステップバイステップ方法論の視覚的手順を含む注射のための単純化されたプロトコルが提供され、特殊な機器を必要とせず、胚微小注射をバイパスする。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近、さまざまな生物学的な質問2、3、7、17のモデル生物としてのナッソニア・ビトリペンシスの使用が増加したことで、N.ビトリペンシス遺伝子の機能解析のための単純化された効率的なプロトコルを可能にする注入方法を開発し、最適化する必要があります。遺伝子編集試薬の胚…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業の一部は、O.S.A.とNSF/BIO助成金1645331 J.L.Rに向けられたUCSDスタートアップファンドによって支えられた。
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
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