胚胎注射用于CRISPR介导的诱变在蚂蚁Harpegnathos盐化剂中
Summary
昆虫真社会性的许多特征依赖于殖民地内的交流和分工。通过显微注射和CRISPR介导的诱变对蚂蚁胚胎中关键调控基因的遗传操作为真社会昆虫利他行为的本质提供了见解。
Abstract
真社会性昆虫的独特性状，如社会行为和生殖分工，受其遗传系统控制。为了解决基因如何调节社会性状的问题，我们通过在合胞阶段将CRISPR复合物递送到年轻胚胎中来开发突变蚂蚁。在这里，我们提供了Harpegnathos saltator中CRISPR介导的诱变方案， Harpegnathos盐酸盐是一种具有显着表型可塑性的ponerine ant物种。 盐蚂蚁 很容易在实验室环境中饲养。收集胚胎用于用Cas9蛋白显微注射，并使用自制石英针在 体外 合成小向导RNA（sgRNA）。注射后胚胎在菌落外饲养。在第一批幼虫出现后，所有胚胎和幼虫都被运送到一个巢箱中，由一些护理人员进行进一步发育。该协议适用于诱导诱变，以分析蚂蚁的种姓特异性生理和社会行为，但也可以应用于更广泛的膜翅目动物和其他昆虫。
Introduction
昆虫的真社会性进化，即膜翅目和Blottodea目（以前称为等翅目）的进化，导致了独特且通常复杂的行为特征，这些特征在个体和群体水平上都表现出来。生殖分工是最先进的社会昆虫群体的特征，通常涉及由几个行为上和通常形态上不同的群体组成的种姓系统。种姓之间的这种行为和形态多样性不仅受其遗传系统的控制，而且通常受环境控制1，2，3，4，使真社会昆虫成为遗传和表观遗传研究的有吸引力的对象。
操纵真社会昆虫遗传系统的能力已被证明具有挑战性，因为许多物种不在实验室环境中交配和繁殖。大多数真社会昆虫在一个群体中的生殖个体也很少，限制了可以产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量5。此外，与通常用于遗传研究的昆虫（如 果蝇）相比，许多真社会昆虫的生成时间较长，增加了建立遗传系的难度5。然而，一些真社会物种可以在殖民地中产生很大比例的生殖活跃个体，这减轻了挑战并为建立突变或转基因系提供了机会。
就蚂蚁种类Harpegnathos saltator而言，所有女性工人都可以在蜂王死亡或社会孤立时变得生殖活跃。这些工人被称为“玩家门”，可用于生成新的殖民地6。此外，一个群体中可能存在多个玩家门，从而增加后代产量5，7，8。到目前为止，已经在欧洲蜜蜂Apis mellifera和蚂蚁物种H. saltator，Ooceraea biroi和Solenopsis invicta9，10，11，12，13，14，15中开发了突变和/或转基因品系。.对群居蜜蜂和蚂蚁的遗传分析为更好地理解真社会性铺平了道路，为研究基因及其对真社会昆虫行为和种姓特定生理学的影响提供了一系列机会。
在这里，我们提供了一个通过H . saltator中的CRISPR / Cas9系统进行基因修饰的方案。具体来说，该技术用于在orco中产生种系突变， orco是编码所有气味受体（OR）的专性共受体的基因10。 OR 基因在膜翅目真社会昆虫中显著扩增16， orco 在昆虫嗅觉中起重要作用;如果没有它，手术室不会正常组装或运行。因此， orco 基因的突变会破坏嗅觉，神经发育和相关的社会行为9，10。
在该协议中，使用显微注射将Cas9蛋白和小向导RNA（sgRNA）引入蚂蚁胚胎中，以诱导靶基因的诱变。在这里，我们将详细描述显微注射程序以及有关菌落和注射胚胎护理的说明。这些方法适用于诱导 盐蚂 蚁中各种不同基因的诱变，并且可以应用于更广泛的膜翅目昆虫。
Protocol
Representative Results
Discussion
昆虫（包括蚂蚁，蜜蜂，黄蜂和白蚁）之间真社会性的进化导致了新的行为和形态特征的出现，其中许多被认为受到环境和遗传因素的组合影响1，2，3，4。不幸的是，真社会昆虫作为遗传学领域研究模型的吸引力和有用性受到与该群体中诱变相关的困难的阻碍。这种障碍是由于生殖分工而发生的，这…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢纽约大学的Danny Reinberg和Claude Desplan实验室以及亚利桑那州立大学Jürgen Liebig实验室对蚂蚁遗传学的支持。华严感谢美国国家科学基金会I/UCRC、节肢动物管理技术中心（资助号IIP-1821914）和行业合作伙伴的支持。玛雅萨尔得到了美国 – 以色列两国农业研究与发展基金，Vaadia-BARD博士后奖学金编号FI-595-19的支持。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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