Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos
Summary
Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.
Abstract
As características únicas dos insetos eussociais, como o comportamento social e a divisão reprodutiva do trabalho, são controladas por seu sistema genético. Para abordar como os genes regulam os traços sociais, desenvolvemos formigas mutantes através da entrega do complexo CRISPR em embriões jovens durante seu estágio sincicial. Aqui, fornecemos um protocolo de mutagênese mediada por CRISPR em Harpegnathos saltator, uma espécie de formiga ponerina que exibe impressionante plasticidade fenotípica. As formigas H. saltator são prontamente criadas em um ambiente de laboratório. Os embriões são coletados para microinjeção com proteínas Cas9 e RNAs guia sintetizados in vitro (sgRNAs) usando agulhas de quartzo caseiras. Os embriões pós-injeção são criados fora da colônia. Após o surgimento da primeira larva, todos os embriões e larvas são transportados para uma caixa de ninho com alguns trabalhadores de enfermagem para posterior desenvolvimento. Este protocolo é adequado para induzir mutagênese para análise da fisiologia específica da casta e do comportamento social em formigas, mas também pode ser aplicado a um espectro mais amplo de himenópteros e outros insetos.
Introduction
A evolução da eussocialidade em insetos, nomeadamente os das ordens Hymenoptera e Blattodea (anteriormente Isoptera), resultou em traços comportamentais únicos e muitas vezes sofisticados que se manifestam tanto a nível individual como a nível de colónia. A divisão reprodutiva do trabalho, uma característica que caracteriza os grupos mais avançados de insetos sociais, geralmente envolve sistemas de castas compostos de vários grupos comportamentalmente e muitas vezes morfologicamente distintos. Essa diversidade comportamental e morfológica entre as castas é controlada não apenas por seu sistema genético, mas também, muitas vezes, pelo ambiente 1,2,3,4, tornando os insetos eussociais sujeitos atraentes para pesquisas genéticas e epigenéticas.
A capacidade de manipular o sistema genético de insetos eussociais provou ser um desafio, pois muitas espécies não acasalam e se reproduzem em ambientes de laboratório. A maioria dos insetos eussociais também possui pouquíssimos indivíduos reprodutivos em uma colônia, limitando o número de descendentes que podem ser produzidos e, consequentemente, limitando o tamanho da amostra para manipulação genética5. Além disso, muitos insetos eussociais têm longos tempos de geração em comparação com insetos comumente utilizados para estudos genéticos (como Drosophila), aumentando a dificuldade de estabelecer linhagens genéticas5. Algumas espécies eussociais, no entanto, podem gerar uma grande proporção de indivíduos reprodutivamente ativos em uma colônia, o que alivia os desafios e oferece oportunidades para estabelecer linhas mutantes ou transgênicas.
No caso da espécie de formiga ponerina, Harpegnathos saltator, todas as operárias podem se tornar reprodutivamente ativas após a morte de uma rainha ou isolamento social. Esses trabalhadores são chamados de “gamergates” e podem ser usados para gerar novas colônias6. Além disso, pode haver mais de um gamergate presente em uma colônia, aumentando assim a produção de descendentes 5,7,8. Até o momento, linhagens mutantes e/ou transgênicas foram desenvolvidas na abelha europeia, Apis mellifera, e nas espécies de formigas, H. saltator, Ooceraea biroi e Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Análises genéticas em abelhas e formigas sociais abriram o caminho para uma melhor compreensão da eussocialidade, proporcionando uma série de oportunidades para estudar genes e seus impactos no comportamento de insetos eussociais e na fisiologia específica da casta.
Aqui, fornecemos um protocolo para modificação genética através do sistema CRISPR/Cas9 em H. saltator. Especificamente, essa técnica foi utilizada para gerar uma mutação germinativa em orco, o gene que codifica o co-receptor obrigatório de todos os receptores odorantes (ORs)10. Os genes OR foram notavelmente expandidos em insetos himenópteros eussociais16, e o orco desempenha um papel essencial no olfato de insetos; na sua ausência, as OR não se reúnem ou funcionam normalmente. Mutações do gene orco, portanto, perturbam a sensação olfativa, o desenvolvimento neural e os comportamentos sociais associados 9,10.
Neste protocolo, proteínas Cas9 e pequenos RNAs guia (sgRNAs) são introduzidos em embriões de formigas usando microinjeção com a finalidade de induzir a mutagênese de um gene alvo. Aqui, descreveremos o procedimento de microinjeção em detalhes, juntamente com instruções sobre o cuidado de colônias e embriões injetados. Esses métodos são apropriados para induzir mutagênese em uma variedade de genes diferentes em formigas H. saltator e podem ser aplicados a um espectro mais amplo de insetos himenópteros.
Protocol
Representative Results
Discussion
A evolução da eussocialidade entre insetos, incluindo formigas, abelhas, vespas e cupins, resultou no aparecimento de novos traços comportamentais e morfológicos, muitos dos quais são entendidos como influenciados por uma combinação de fatores ambientais e genéticos 1,2,3,4. Infelizmente, a atratividade e a utilidade dos insetos eussociais como modelos de pesquisa no campo da genética …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos laboratórios de Danny Reinberg e Claude Desplan na Universidade de Nova York e ao laboratório de Jürgen Liebig na Arizona State University por seu apoio à genética de formigas. Hua Yan reconhece o apoio da National Science Foundation I / UCRC, do Centro de Tecnologias de Gerenciamento de Artrópodes sob o Grant No. IIP-1821914 e por parceiros da indústria. Maya Saar foi apoiada pelos Estados Unidos – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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