Summary

Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi

Published: February 09, 2021
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Summary

De nombreuses caractéristiques de l’eusocialité des insectes reposent sur la communication au sein de la colonie et la division du travail. La manipulation génétique des gènes régulateurs clés dans les embryons de fourmis par micro-injection et mutagénèse médiée par CRISPR donne un aperçu de la nature du comportement altruiste chez les insectes eusociaux.

Abstract

Les traits uniques des insectes eusociaux, tels que le comportement social et la division reproductive du travail, sont contrôlés par leur système génétique. Pour comprendre comment les gènes régulent les traits sociaux, nous avons développé des fourmis mutantes via l’administration du complexe CRISPR dans de jeunes embryons au cours de leur phase syncytiale. Ici, nous fournissons un protocole de mutagénèse médiée par CRISPR dans Harpegnathos saltator, une espèce de fourmi ponérine qui présente une plasticité phénotypique frappante. Les fourmis H. saltator sont facilement élevées en laboratoire. Les embryons sont collectés pour la micro-injection avec des protéines Cas9 et des petits ARN guides synthétisés in vitro (ARNsg) à l’aide d’aiguilles de quartz faites maison. Les embryons post-injection sont élevés à l’extérieur de la colonie. Après l’émergence de la première larve, tous les embryons et les larves sont transportés dans un nichoir avec quelques travailleurs infirmiers pour un développement ultérieur. Ce protocole convient pour induire la mutagénèse pour l’analyse de la physiologie spécifique à la caste et du comportement social chez les fourmis, mais peut également être appliqué à un spectre plus large d’hyménoptères et d’autres insectes.

Introduction

L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, à savoir ceux des ordres Hymenoptera et Blattodea (anciennement Isoptera), a abouti à des traits comportementaux uniques et souvent sophistiqués qui se manifestent à la fois au niveau individuel et au niveau de la colonie. La division reproductive du travail, un trait caractérisant les groupes les plus avancés d’insectes sociaux, implique souvent des systèmes de castes composés de plusieurs groupes comportementaux et souvent morphologiquement distincts. Cette diversité comportementale et morphologique entre les castes est contrôlée non seulement par leur système génétique, mais aussi souvent par l’environnement 1,2,3,4, faisant des insectes eusociaux des sujets attrayants pour la recherche génétique et épigénétique.

La capacité de manipuler le système génétique des insectes eusociaux s’est avérée difficile, car de nombreuses espèces ne s’accouplent pas et ne se reproduisent pas en laboratoire. La plupart des insectes eusociaux ont également très peu d’individus reproducteurs dans une colonie, ce qui limite le nombre de descendants pouvant être produits et, par conséquent, limite la taille de l’échantillon pour la manipulation génétique5. De plus, de nombreux insectes eusociaux ont des temps de génération longs par rapport aux insectes couramment utilisés pour les études génétiques (tels que la drosophile), ce qui ajoute à la difficulté d’établir des lignées génétiques5. Certaines espèces eusociales, cependant, peuvent générer une grande proportion d’individus actifs sur le plan de la reproduction dans une colonie, ce qui atténue les défis et offre des possibilités d’établir des lignées mutantes ou transgéniques.

Dans le cas de l’espèce de fourmi ponérine, Harpegnathos saltator, toutes les travailleuses peuvent devenir actives sur le plan reproductif à la mort d’une reine ou à l’isolement social. Ces ouvrières sont appelées « gamégates » et peuvent être utilisées pour générer de nouvelles colonies6. De plus, il peut y avoir plus d’un gamergate présent dans une colonie, augmentant ainsi la production de progéniture 5,7,8. Jusqu’à présent, des lignées mutantes et/ou transgéniques ont été développées chez l’abeille européenne Apis mellifera, et chez les espèces de fourmis, H. saltator, Ooceraea biroi et Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Les analyses génétiques chez les abeilles sociales et les fourmis ont ouvert la voie à une meilleure compréhension de l’eusocialité, offrant un éventail d’opportunités pour étudier les gènes et leurs impacts sur le comportement des insectes eusociaux et la physiologie spécifique à la caste.

Ici, nous fournissons un protocole de modification génétique via le système CRISPR / Cas9 dans H. saltator. Plus précisément, cette technique a été utilisée pour générer une mutation germinale chez l’orco, le gène codant pour le corécepteur obligatoire de tous les récepteurs odorants (OR)10. Les gènes OR ont été remarquablement développés chez les insectes eusociaux hyménoptères16, et l’orco joue un rôle essentiel dans l’olfaction des insectes; en son absence, les RO ne s’assemblent pas et ne fonctionnent pas normalement. Les mutations du gène orco perturbent donc la sensation olfactive, le développement neuronal et les comportements sociaux associés 9,10.

Dans ce protocole, les protéines Cas9 et les petits ARN guides (ARNg) sont introduits dans les embryons de fourmis par micro-injection dans le but d’induire la mutagénèse d’un gène cible. Ici, nous décrirons la procédure de micro-injection en détail ainsi que les instructions concernant les soins des colonies et des embryons injectés. Ces méthodes sont appropriées pour induire la mutagénèse dans une variété de gènes différents chez les fourmis H. saltator et peuvent être appliquées à un spectre plus large d’insectes hyménoptères.

Protocol

1. Entretien régulier des colonies de salateurs d’Harpegnathos Maintenir des colonies sauvages de H. saltator dans des boîtes en plastique transparent dans une salle d’élevage de fourmis à 22-25 °C et une photopériode de 12 heures de lumière : 12 heures d’éclairage sombre (12L:12D).Utilisez de petites boîtes (9,5 x 9,5 cm2) pour élever des ouvrières individuelles ou de petites colonies. Utilisez des boîtes moyennes (19 x 13,5 cm 2) ou de grandes …

Representative Results

En utilisant le protocole fourni ici, l’édition du génome dans les embryons salateurs d’Harpegnathos a été réalisée avec succès. Ces résultats ont été validés par réaction en chaîne de la polymérase et clonage pGEM de l’ADN extrait d’embryons injectés, suivi d’un séquençage de l’ADN. L’efficacité de la mutagénèse somatique à l’aide de ce protocole a atteint environ 40%. Les mâles mutants F1 ont été accouplés à des femelles de type sauvage…

Discussion

L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, y compris les fourmis, les abeilles, les guêpes et les termites, a entraîné l’apparition de nouveaux traits comportementaux et morphologiques, dont beaucoup sont influencés par une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques 1,2,3,4. Malheureusement, l’attrait et l’utilité des insectes eusociaux en tant que modèles d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les laboratoires de Danny Reinberg et Claude Desplan à l’Université de New York et le laboratoire de Jürgen Liebig à l’Arizona State University pour leur soutien sur la génétique des fourmis. Hua Yan reconnaît le soutien de la National Science Foundation I / UCRC, du Center for Arthropod Management Technologies sous le numéro de subvention IIP-1821914 et des partenaires de l’industrie. Maya Saar a été soutenue par le Fonds binational de recherche et de développement agricoles États-Unis – Israël, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.

Materials

Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher 15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration PNA Bio CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet Hypogloss Products B00254CNJA The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope  Nikon Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip BioQuip 4748
FemtoJet ll microinjector Eppendorf 920010504 This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
NCBI database National Center for Biotechnology Information Gene ID: 105183395 
P-2000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) Pioneer Plastics 079C 
Plastic boxes (27 X 19 cm2) Pioneer Plastics 195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) Pioneer Plastics 028C 
Quartz glass without filament Sutter Instruments Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 Winsor and Newton 5301030

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Cite This Article
Sieber, K., Saar, M., Opachaloemphan, C., Gallitto, M., Yang, H., Yan, H. Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator . J. Vis. Exp. (168), e61930, doi:10.3791/61930 (2021).

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