Summary
Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.
Abstract
De unieke eigenschappen van eusociale insecten, zoals sociaal gedrag en reproductieve arbeidsverdeling, worden gecontroleerd door hun genetische systeem. Om aan te pakken hoe genen sociale eigenschappen reguleren, hebben we gemuteerde mieren ontwikkeld via toediening van CRISPR-complex in jonge embryo's tijdens hun syncytiele stadium. Hier bieden we een protocol van CRISPR-gemedieerde mutagenese in Harpegnathos saltator, een ponerinemierensoort die opvallende fenotypische plasticiteit vertoont. H. saltatormieren worden gemakkelijk gekweekt in een laboratoriumomgeving. Embryo's worden verzameld voor micro-injectie met Cas9-eiwitten en in vitro gesynthetiseerde kleine gids RNA's (sgRNA's) met behulp van zelfgemaakte kwartsnaalden. Embryo's na injectie worden buiten de kolonie grootgebracht. Na het ontstaan van de eerste larve worden alle embryo's en larven met enkele verpleegsters naar een nestkast getransporteerd voor verdere ontwikkeling. Dit protocol is geschikt voor het induceren van mutagenese voor analyse van kastespecifieke fysiologie en sociaal gedrag bij mieren, maar kan ook worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteranen en andere insecten.
Introduction
De evolutie van eusocialiteit bij insecten, namelijk die van de orden Hymenoptera en Blattodea (voorheen Isoptera), heeft geresulteerd in unieke en vaak geavanceerde gedragskenmerken die zich manifesteren op zowel individueel als kolonieniveau. Reproductieve arbeidsverdeling, een eigenschap die de meest geavanceerde groepen sociale insecten kenmerkt, omvat vaak kastensystemen die bestaan uit verschillende gedragsmatige en vaak morfologisch onderscheidende groepen. Een dergelijke gedrags- en morfologische diversiteit tussen kasten wordt niet alleen gecontroleerd door hun genetisch systeem, maar ook vaak door de omgeving 1,2,3,4, waardoor eusociale insecten aantrekkelijke onderwerpen zijn voor genetisch en epigenetisch onderzoek.
Het vermogen om het genetische systeem van eusociale insecten te manipuleren is een uitdaging gebleken, omdat veel soorten niet paren en zich voortplanten in laboratoriumomgevingen. De meeste eusociale insecten hebben ook zeer weinig reproductieve individuen in een kolonie, waardoor het aantal nakomelingen dat kan worden geproduceerd wordt beperkt en bijgevolg de steekproefgrootte voor genetische manipulatie wordt beperkt5. Bovendien hebben veel eusociale insecten lange generatietijden in vergelijking met insecten die vaak worden gebruikt voor genetische studies (zoals Drosophila), wat bijdraagt aan de moeilijkheid om genetische lijnen vast te stellen5. Sommige eusociale soorten kunnen echter een groot deel van de reproductief actieve individuen in een kolonie genereren, wat de uitdagingen verlicht en mogelijkheden biedt om mutante of transgene lijnen vast te stellen.
In het geval van de ponerinemierensoort, Harpegnathos saltator, kunnen alle vrouwelijke werksters reproductief actief worden na de dood van een koningin of sociaal isolement. Deze arbeiders worden "gamergates" genoemd en kunnen worden gebruikt om nieuwe kolonies te genereren6. Bovendien kan er meer dan één gamergate aanwezig zijn in een kolonie, waardoor de productie van nakomelingenmet 5,7,8 toeneemt. Tot nu toe zijn mutante en/of transgene lijnen ontwikkeld in de Europese honingbij, Apis mellifera, en in de mierensoort, H. saltator, Ooceraea biroi en Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetische analyses bij sociale bijen en mieren hebben de weg vrijgemaakt voor een beter begrip van eusocialiteit, waardoor een scala aan mogelijkheden wordt geboden om genen en hun effecten op eusociale insectengedrag en kastespecifieke fysiologie te bestuderen.
Hier bieden we een protocol voor genetische modificatie via het CRISPR/Cas9-systeem in H. saltator. Specifiek werd deze techniek gebruikt om een kiembaanmutatie te genereren in orco, het gen dat codeert voor de obligate co-receptor van alle odorantreceptoren (OK's)10. OR-genen zijn opmerkelijk uitgebreid in hymenopteriaanse eusociale insecten16, en orco speelt een essentiële rol in de reuk van insecten; bij afwezigheid ervan monteren of functioneren OK's niet normaal. Mutaties van het orco-gen verstoren daarom de reuksensatie, neurale ontwikkeling en geassocieerd sociaal gedrag 9,10.
In dit protocol worden Cas9-eiwitten en kleine gids-RNA's (sgRNA's) in mierenembryo's geïntroduceerd met behulp van micro-injectie met als doel mutagenese van een doelgen te induceren. Hier zullen we de micro-injectieprocedure in detail beschrijven, samen met aanwijzingen met betrekking tot de verzorging van kolonies en geïnjecteerde embryo's. Deze methoden zijn geschikt voor het induceren van mutagenese in een verscheidenheid aan verschillende genen in H. saltatormieren en kunnen worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteraninsecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Regelmatig onderhoud van Harpegnathos saltator kolonies
- Onderhoud wild-type kolonies van H. saltator in transparante plastic dozen in een mierenopfokruimte bij 22-25 ° C en een fotoperiode van 12 uur licht: 12 uur donker (12L: 12D) verlichtingsschema.
- Gebruik kleine dozen (9,5 x 9,5 cm2) om individuele arbeiders of kleine kolonies groot te brengen. Gebruik middelgrote dozen (19 x 13,5 cm2) of grote dozen (27 x 19 cm2) om grotere kolonies te fokken (figuur 1).
- Om nestkasten te maken, gebruik je gips om vloeren voor de dozen te maken. Terwijl de natte pleister in het medium en de grote dozen droogt, drukt u een schuimblok in het gips op een paar centimeter diep en een paar centimeter van de achterkant van de doos om een lager nestgebied aan te wijzen. Zodra de pleister is opgedroogd, bedekt u het aangewezen nestgebied met een vierkant stuk glas.
OPMERKING: In kleine dozen is het niet nodig om een lager nestgebied aan te wijzen. Als mieren verzuimen om het aangewezen onderste nestgebied te gebruiken, kan het helpen om het glas te bedekken met een vierkant stuk rood cellofaan. Dit wekt de indruk van een donkere ondergrondse ruimte die lijkt op nesten die H. saltator in het wild gebruikt en kan hen aanmoedigen om hun broed naar het aangewezen gebied te verplaatsen.
- Voer kolonies twee keer per week met levende krekels.
OPMERKING: Kolonies moeten voldoende worden gevoed dat ze alle krekels consumeren voorafgaand aan hun volgende voeding. Voed alle geïsoleerde mieren en mutante mierenkolonies met krekels die 2-3 keer per week vooraf worden gestoken door werknemers van een reguliere kolonie. - Breng regelmatig water aan op de gipsen nestkastvloer met behulp van een wasfles.
OPMERKING: De pleister moet vochtig genoeg zijn om niet stoffig aan te raken, maar het moet droog genoeg zijn dat al het toegevoegde water door de pleister wordt opgenomen. Het is belangrijk dat de nesten niet overmatig worden bewaterd. Gemiddeld hebben nestkasten een kleine hoeveelheid water nodig die eenmaal per week wordt toegevoegd. - Wanneer het voeren plaatsvindt, verwijder dan afval en dode individuen. Vries al het afval en dode mieren 's nachts in bij -30 °C voordat u deze materialen als gewoon afval weggooit.
- Voeg periodiek een snufje gedroogd zaagsel toe aan kolonies; dit helpt larven bij het verpoppen en helpt werksters de nestkast schoon te houden.
2. Bereiding van micro-injectienaalden van kwartsglas
- Gebruik een micropipettetrekker om glazen micro-injectienaalden te trekken.
- Selecteer het glas dat u wilt trekken. Zorg ervoor dat het gebruikte glas is opgeslagen in een stofvrije en schone omgeving.
OPMERKING: Hier is dunwandig filamenteus kwartsglas met een buitendiameter van 1,0 mm, een binnendiameter van 0,5 mm en een lengte van 7,5 cm gebruikt om micro-injectienaalden te produceren. Bij het injecteren van een embryo met een zacht lichaam kunnen borosilicienaalden ook van toepassing zijn, maar borosilicienaalden kunnen niet doordringen in hard chorion. - Stel de parameterinstellingen van de trekker in. Gebruik een proces in twee stappen om micro-injectienaalden te trekken voor H. saltator-embryo's : parameters voor de eerste stap omvatten warmte van 575, filament van 3, snelheid van 35, vertraging van 145 en een trekkracht van 75; parameters van de tweede stap omvatten warmte van 425, filament van 0, snelheid van 15, vertraging van 128 en een trekkracht van 200. Zorg er na de tweede stap voor dat de resulterende naald een 2 mm taps toelopende naald heeft en een punt van 0,5 μm (figuur 2).
OPMERKING: Deze set parameters, samen met parameters voor andere naaldtypen, is te vinden in de bedieningshandleiding17. Handleidingen voor pipettrekkers bieden vaak aanbevolen parameters voor een verscheidenheid aan technieken. Er kan wat vallen en opstaan nodig zijn om te bepalen welke parameters de beste naalden genereren voor specifieke behoeften. Een korte taper is ideaal voor H. saltator injecties, omdat het het harde chorion van H. saltator embryo's kan binnendringen. Als het injecteren van een zacht embryo, zoals een embryo dat is gedechorioneerd (bijv. Drosophila), kan een langere taper rond 10 mm betere resultaten opleveren. Bedieningshandleidingen voor pipettrekkers bieden meestal specifieke parameters voor het trekken van naalden die geschikt zijn voor verschillende behoeften. Het is belangrijk dat handschoenen worden gedragen bij het hanteren van glazen filamenten en het trekken van naalden. Oliën uit blote handen kunnen op het glas worden overgebracht als er geen handschoenen worden gedragen. - Zodra de parameters zijn ingesteld, gebruikt u een micropipettetrekker om naalden te trekken voor micro-injectie. Zorg ervoor dat naalden in een stofvrije en schone omgeving worden bewaard totdat ze worden gebruikt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vers getrokken micro-injectienaalden te gebruiken. Als voorgetrokken naalden worden gebruikt, moeten ze op de juiste manier in een doos worden bewaard om schade aan naaldpunten en mogelijke verontreiniging te voorkomen. Naalden die langdurige opslag hebben ondergaan, worden niet aanbevolen voor embryo-injecties.
3. Bereiding van de micro-injector
- Gebruik een microinjector om gewenste materialen in mierenembryo's te injecteren.
- Bereid het micro-injectiemengsel van Cas9-eiwitten en in vitro gesynthetiseerde small guide RNA's (sgRNA's)10. Houd het mengsel op ijs totdat het tijd is om een micro-injectienaald te laden. Bewaar het micro-injectiemengsel bij -80 °C wanneer het niet in gebruik is.
OPMERKING: De concentraties variëren in verschillende soorten. Een hoge concentratie kan een hoge mortaliteit veroorzaken, terwijl een lage concentratie de efficiëntie kan verminderen. We gebruiken 0,2 μg/μL Cas9 eiwitten en 0,2 μg/μL sgRNA's voor H. saltator embryo injectie. Het ontwerp van onze sgRNA's volgde een eerder vastgesteld protocol18. Gensequenties werden verkregen uit DNA-databanken. De genoomsequentie van H. saltator werd eerder ook gemeld19,20. - Pas de injectieparameters voor H. saltator-embryo's aan: een injectiedruk van 140 hectopascal (hPa), een constante druk van 70 hPa en een tijd van 0,4 seconden. Pas de constante druk zodanig aan dat het materiaal slechts in één richting stroomt. Pas de injectiedruk en -tijd alleen aan als er geen materiaal van de naald in het embryo stroomt.
OPMERKING: Bij het injecteren van een ander type embryo is de primaire parameter die kan veranderen constante druk, die ervoor zorgt dat vloeistof uit het embryo niet terugvloeit in de naald. Het volume wordt niet geregeld in dit protocol. Het instellen van de parameters van de microinjector is voldoende voor het verkrijgen van consistente injecties. - Laad een microinjectielaald met 2 μL van het mengsel met behulp van pipetpunten van de microlader. Doe dit langzaam om ervoor te zorgen dat er geen bubbels in het mengsel worden gevormd.
OPMERKING: Als er bubbels ontstaan, kan het moeilijk zijn om consistente micro-injecties te behouden. - Breek alleen de punt van de naald door langs de rand van de tape te breken, zodat een smalle taps toelopende band nog steeds wordt gehandhaafd. Zorg ervoor dat de naald net genoeg gebroken is dat de punt wordt geopend, maar niet zozeer dat de taper wordt afgebroken.
OPMERKING: Belangrijk is dat als de opening van de naald te breed is na het breken, de gebruiker vloeistof uit de naald ziet lopen wanneer deze op de onder druk staande micro-injector wordt gemonteerd voordat de injectiedruk wordt uitgeoefend. Sommige micro-injectieprotocollen adviseren het breken van naalden door de punt met een schaar te knippen. Deze methode wordt niet geadviseerd, omdat een schaar ervoor kan zorgen dat de punt van de naald verbrijzelt. Het injecteren van embryo's met een verbrijzelde naald zal zeer schadelijk zijn. - Monteer de naald op de micromanipulator
4. Injectie van embryo's
- Selecteer embryo's voor micro-injectie uit het syncytiestadium: de tijd tijdens de ontwikkeling waarin kernen zich delen zonder cytokinese.
OPMERKING: Dit is het ideale moment tijdens de ontwikkeling voor genoombewerking door micro-injectie, zoals eerder ontdekt in Drosophila21. H. saltator-embryo's passeren het syncytiele stadium en bereiken cellularisatie rond 36 uur na eiafzetting10. Hogere efficiëntie wordt bereikt als jongere embryo's worden gebruikt voor injecties. - Lijn embryo's op een stuk dubbelzijdige tape geplakt op een glazen microscoopglaasje. Zorg ervoor dat embryo's goed aan de tape zijn bevestigd om beweging tijdens de injectie te voorkomen. Leg de embryo's in een verticale oriëntatie, zodat de zijkant van het embryo zich aan de rand van de tape bevindt (figuur 3). Plaats de dia en de beklede embryo's op het stadium van de microscoop op een aangewezen micro-injectiewerkstation.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de embryo's zo zijn gerangschikt dat opeenvolgende injecties kunnen worden uitgevoerd door de dia op het podium te bewegen in plaats van de naaldpositie bij elke injectie aan te passen. Hierdoor kunnen opeenvolgende injecties efficiënter worden uitgevoerd. - Lijn de naald uit met het eerste embryo dat met behulp van de micromanipulator wordt geïnjecteerd (figuur 4a).
- Prik de naald zijdelings in het eerste embryo langs de dorsale/ventrale as onder een microscoop.
- Injecteer het micro-injectiemengsel. Zoek naar een lichte beweging van het embryo, wat wijst op een toename van de interne druk als gevolg van de geïnjecteerde vloeistof. Let bovendien op de vorming van een kleine druppel met zichtbaar sporen van weefsel en/of lipide op het buitenmembraan van het embryo (figuur 4b).
OPMERKING: Aanwezigheid van sporen van weefsel en / of lipide in de druppel geeft aan dat de naald met succes zowel chorion als vitellinemembraan van het embryo heeft doorboord. Als er geen sporen van deze materialen aanwezig zijn, is de injectie niet met succes uitgevoerd en moet deze worden herhaald. Na enkele seconden wordt de druppel opnieuw geabsorbeerd door het embryo en is deze niet meer zichtbaar. - Verwijder de naald voorzichtig onmiddellijk uit het embryo en ga verder met de volgende door de positie van de microscoopglaasje aan te passen. Herhaal dit totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd.
- Zodra alle embryo's op de dia met succes zijn geïnjecteerd, brengt u de dia gedurende 1 uur over naar een vochtige doos om de embryo's de tijd te geven om te herstellen van het injectieproces voordat ze uit de dia worden verwijderd.
5. Opfokken van geïnjecteerde embryo's
- Verwijder na 1 uur incubatie in een vochtige doos voorzichtig de geïnjecteerde embryo's van de tape met een vederlichte tang en breng ze over in een buis gevuld met een kleine hoeveelheid 70% ethanol. Keer de buis meerdere keren om om de embryo's naar de bodem van de buis te brengen. Herhaal de ethanolwas eenmaal, gevolgd door drie wasbeurten met geautoclaveerd water.
- Breng met behulp van een kleine en zachte kwast alle geïnjecteerde embryo's over op 1% agarplaten met 2% antibioticum-antimycotisch. Breng het antibioticum-antimycotisch aan nadat gegoten agarplaten zijn afgekoeld door over het oppervlak van de plaat te verspreiden met behulp van een celverspreider. Sluit de agarplaat af met parafilm om agar-uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Probeer niet om geïnjecteerde embryo's na injecties terug te brengen naar een kolonie, omdat werknemers de meeste geïnjecteerde embryo's kunnen vernietigen. Overleving wordt daarom geoptimaliseerd door embryo's te laten ontwikkelen op agarplaten buiten een normale kolonieomgeving. - Incubeer de agarplaten bij 25 °C gedurende ongeveer 4 weken. Controleer regelmatig op uitkomen.
- Zodra het eerste embryo is uitgebroed tot een larve, breng je alle embryo's en larven terug naar een nestkast met een paar jonge verpleegsters om voor de jongen te zorgen. Voer met krekels die vooraf zijn gestoken door een grotere kolonie van het wilde type, verwijder afvalproducten en voeg water toe volgens hetzelfde protocol dat in sectie 1 wordt besproken.
OPMERKING: Kleine dozen (9,5 x 9,5 cm2) zijn ideaal voor dergelijke kolonies. H. saltator plant zich goed voort in gevangenschap. Daarom kunnen gemuteerde embryo's worden grootgebracht tot volwassenheid. Isolatie van gemuteerde volwassene(n) induceert de overgang naar de reproductieve gamergate-fase. Gecontroleerde kruisingen worden gebruikt om mutantenkolonies te vestigen met heterozygote of homozygote individuen (figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het hier verstrekte protocol werd genoombewerking in Harpegnathos saltator-embryo's met succes uitgevoerd. Deze resultaten werden gevalideerd via polymerasekettingreactie en pGEM-klonen van DNA geëxtraheerd uit geïnjecteerde embryo's gevolgd door DNA-sequencing. De efficiëntie van somatische mutagenese met behulp van dit protocol bereikte ongeveer 40%. F1-mutante mannetjes werden gepaard met wilde vrouwtjes om heterozygote F2-vrouwtjes te produceren die, als ze niet gepaard gingen, F3-mannetjes produceerden. Gemuteerde F3-mannetjes werden gepaard met heterozygote vrouwtjes om F4 homozygote mutante vrouwtjes te produceren. De afwezigheid van het doelpeptide werd verder bevestigd via massaspectrometrie van deze F4 homozygote vrouwelijke individuen. Vleugels werden van mannetjes geknipt met behulp van een microdissectieschaar en gebruikt voor genotyperingsdoeleinden. Omdat arbeiders geen vleugels hebben, worden ze normaal gesproken geofferd en gegenotypeerd na experimenten. Als gevolg van succesvolle mutagenese werden ongebruikelijke gedragingen waargenomen, die correleerden met verlies van het doelgen. Het verlies van orco resulteerde in abnormaal gedrag gerelateerd aan verlies van feromoondetectie, onvermogen om prooien te detecteren, verminderde vruchtbaarheid en zwerven uit de kolonie. Bovendien vertoonden orco-mutante mieren een verminderd aantal odorantreceptorneuronen en antennekwabglomeruli, wat suggereert dat de neuroanatomie bij mieren afhankelijk is van de functionaliteit van de odorantreceptor10.
Figuur 1: Harpegnathos zoutvangernesten. (A) Uiterlijke kenmerken van een nestkast van 19 x 13,5 cm2 met daarin een H. saltatorkolonie. (B) Interne kenmerken van een nestkast van 19 x 13,5 cm2 met daarin een H. saltatorkolonie. Let op de aanwezigheid van een lager nestgebied onder een vierkant stuk glas. (C) Uiterlijke kenmerken van een nestkast van 9,5 x 9,5 cm2 met daarin een kleine H. saltatorkolonie. Zo'n nestkast is ook geschikt voor geïsoleerde werksters en mutantenkolonies. (D) Interne kenmerken van een nestkast van 9,5 x 9,5 cm2 met daarin een kleine H. saltatorkolonie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Naald voor Harpegnathos saltator embryo microinjectie. Let op de dunne taps toelopende naald (gemarkeerd met een pijl). De naald kan worden geopend door de punt iets te breken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Uitlijning van embryo's op dubbelzijdige tape. Embryo's moeten zo worden uitgelijnd dat hun lengte evenwijdig is aan de lange rand van de tape. Hierdoor kunnen opeenvolgende injecties met gemak worden uitgevoerd door de glijbaan op het podium te bewegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Embryo en naald zoals gezien tijdens micro-injectie. (A) Juiste uitlijning van de naald met het embryo voorafgaand aan de injectie. De naald rust loodrecht op het middelpunt van de zijkant van het embryo, de typische injectieplaats. (B) Het embryo en de naald na een succesvolle injectie. Een klein druppeltje steekt uit de zijkant van het embryo (gemarkeerd met een pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Diagram van basismutantenkruisingen. CRISPR kan mutaties op het doelgen induceren bij F0-vrouwen, die vervolgens op volwassen leeftijd worden geïsoleerd om de gamergate-overgang te induceren. Als mutaties optreden in kiembaancellen, kunnen ongetemde gamergates gemuteerde mannelijke eieren leggen. De F1-mutante volwassen mannetjes kunnen worden gepaard met wildtype vrouwtjes om heterozygote nakomelingen te genereren, of ze kunnen worden gepaard met heterozygote vrouwtjes om homozygote of heterozygote nakomelingen te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De evolutie van eusocialiteit bij insecten, waaronder mieren, bijen, wespen en termieten, heeft geresulteerd in het verschijnen van nieuwe gedrags- en morfologische eigenschappen, waarvan er vele worden verondersteld te worden beïnvloed door een combinatie van omgevings- en genetische factoren 1,2,3,4. Helaas is de aantrekkelijkheid en bruikbaarheid van eusociale insecten als onderzoeksmodellen op het gebied van genetica belemmerd door de moeilijkheden die gepaard gaan met mutagenese in deze groep. Deze belemmering treedt op als gevolg van reproductieve arbeidsdeling, een belangrijke eigenschap van eusociale insecten waarbij slechts enkele leden van een kolonie zich kunnen voortplanten. Deze eigenschap legt beperkingen op aan het aantal gemuteerde nakomelingen en maakt de ontwikkeling van genetische lijnen uitdagend5. De ponerinemierensoort, Harpegnathos saltator, biedt een oplossing voor dit dilemma, omdat alle vrouwtjes in staat zijn om reproductieve gamergates te worden wanneer ze worden geïsoleerd5. Hier bieden we methoden voor mutagenese in H. saltator met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem, afgeleverd via embryo-micro-injectie.
Goed kolonieonderhoud en selectie van embryo's in het juiste ontwikkelingsstadium voor micro-injectie zijn van cruciaal belang. Eerder werk stelde vast dat het syncytiele stadium in de ontwikkeling van insecten de ideale fase is voor genoombewerking21, maar de timing van deze fase in de embryonale ontwikkeling van H. saltator was voorheen onbekend. Via nucleaire kleuring van vroege embryosecties konden we vaststellen dat het syncytiele stadium in H. saltator-embryo's duurt tot 36 uur na eiafzetting, waardoor we konden bepalen wanneer we nieuwe embryo's moesten selecteren voor micro-injectie10.
Het selecteren van parameters voor het trekken van naalden en voor micro-injectie kan een uitdaging zijn. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het selecteren van parameters voor het trekken van naalden zijn (1) het type glas dat wordt gebruikt, (2) het gewenste doel van de naald, (3) de gewenste tipgrootte, (4) de hoeveelheid weerstand die de naald zal ervaren tijdens injectie, (5) de gewenste taps toelopende lengte en (6) het type cel of organisme dat zal worden geïnjecteerd. Suggesties en richtlijnen voor het trekken van verschillende soorten naalden zijn te vinden in verschillende bedieningshandleidingen17. Evenzo zijn er factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het selecteren van parameters voor micro-injectie, waaronder (1) de grootte van de naald die wordt gebruikt en (2) de embryo's die moeten worden geïnjecteerd22. Hoewel dit protocol zich richt op micro-injectie in H. saltator-embryo's , kunnen de technieken variëren in andere insecten met wijziging van deze parameters. In het bijzonder zullen de parameters voor het trekken en injecteren van naalden verschillen als het embryo in kwestie zacht of gedechorioneerd is. H. saltator embryo's hebben een taai chorion en injectieresultaten zijn het beste wanneer een naald met een korte taper wordt gebruikt (ongeveer 2 mm). Embryo's met minder stevig chorion kunnen worden geïnjecteerd met naalden met langere taps (ongeveer 10 mm).
In H. saltator kunnen geïnjecteerde embryo's niet onmiddellijk naar een kolonie worden teruggebracht, omdat dit hun vernietiging door verpleegkundig personeel riskeert. Als dit protocol wordt toegepast op andere sociale insectensoorten, is dit mogelijk niet het geval. Het bepalen van de beste post-micro-injectie kweekmethoden bij andere soorten kan wat vallen en opstaan vereisen. In het geval van H. saltator moeten embryo's op agarplaten worden grootgebracht totdat ze uitkomen. Eenmaal uitgekomen, kunnen ze veilig worden teruggebracht naar een kleine kolonie met een paar werknemers om voor het geïnjecteerde broed10 te zorgen. Een vergelijkbare methode van embryozorg wordt gebruikt in vuurmieren (Solenopsis invicta) en klonale raidermieren (Ooceraea biroi) om de overlevingskans van geïnjecteerde embryo's te verhogen 9,15. Bij volwassen eclosie kunnen volwassen gemuteerde vrouwtjes individueel of in kleine kolonies worden gehouden om hun voortplantingscyclus te beginnen. Aanwijzingen voor de verzorging van H. saltator-mutanten worden in dit protocol gegeven, maar als een andere soort wordt gebruikt, moeten aanwijzingen voor de verzorging van geïnjecteerde embryo's en gemuteerde volwassenen worden aangepast aan de behoeften van de soort.
Het protocol dat hier wordt verstrekt, is geoptimaliseerd voor mutagenese, waarbij specifiek niet-essentiële genen worden gericht. In dit geval was het orco-gen gericht en mutaties in orco hadden geen invloed op de overleving van mieren tot volwassenheid. Evenzo kan dit protocol worden gebruikt om zich te richten op andere niet-essentiële genen, waaronder die geassocieerd met andere sensorische receptoren. Als het doelgen essentieel is, zullen in plaats daarvan transgene mieren moeten worden gegenereerd, hetzij via CRISPR of transposon. Transposon-gemedieerde transgenese is gebruikt bij honingbijen13 en kan van toepassing zijn op mieren. Als het gewenste resultaat transgene organismen zijn, zullen de geïnjecteerde materialen anders moeten zijn. Post-injectieprocessen zullen echter vergelijkbaar zijn en daarom zullen sommige aspecten van dit protocol gunstig zijn, ondanks het verschil in het gewenste resultaat.
Over het algemeen is H. saltator ideaal voor gebruik als modelorganisme en voor het uitvoeren van genetische kruisingen vanwege het plastic voortplantingssysteem waarin werknemers zich na isolatie beginnen voort te planten10. Dit onderscheidt deze mierensoort van andere mieren waarin CRISPR/Cas9-technologie is vastgesteld, bijvoorbeeld O. biroi, een soort waarbij alle vrouwtjes zich klanaal voortplanten. H. saltator biedt unieke onderzoeksmogelijkheden onder organismen in zijn soort, omdat genetische afstammingslijnen kunnen worden vastgesteld en mutaties over generaties heen in deze soort kunnen worden gehandhaafd. De nieuwigheid van dit systeem stelt onderzoekers niet alleen in staat om gemuteerde mieren te genereren, maar ook om in de toekomst transgene lijnen te ontwikkelen. Dit biedt mogelijkheden voor nieuw onderzoek om genetische controle van geavanceerde eusocialiteit te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de laboratoria van Danny Reinberg en Claude Desplan aan de New York University en het laboratorium van Jürgen Liebig aan de Arizona State University voor hun steun aan mierengenetica. Hua Yan erkent de steun van de National Science Foundation I/UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies onder Grant No. IIP-1821914 en door partners uit de industrie. Maya Saar werd ondersteund door het United States - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
