Embryoinjektioner til CRISPR-medieret mutagenese i Ant Harpegnathos saltator
Summary
Mange karakteristika ved insekt eusocialitet er afhængige af kommunikation inden for kolonien og arbejdsdeling. Genetisk manipulation af vigtige regulatoriske gener i myreembryoner via mikroinjektion og CRISPR-medieret mutagenese giver indsigt i arten af altruistisk adfærd hos eusociale insekter.
Abstract
De unikke træk ved eusociale insekter, såsom social adfærd og reproduktiv arbejdsdeling, styres af deres genetiske system. For at adressere, hvordan gener regulerer sociale træk, har vi udviklet mutante myrer via levering af CRISPR-kompleks til unge embryoner i deres synkroniale fase. Her leverer vi en protokol af CRISPR-medieret mutagenese i Harpegnathos saltator, en ponerinmyreart, der viser slående fænotypisk plasticitet. H. saltatormyrer opdrættes let i en laboratorieindstilling. Embryoner opsamles til mikroinjektion med Cas9-proteiner og in vitro-syntetiserede små guide-RNA’er (sgRNA’er) ved hjælp af hjemmelavede kvartsnåle. Fostre efter injektion opdrættes uden for kolonien. Efter fremkomsten af den første larve transporteres alle embryoner og larver til en redekasse med et par plejearbejdere til videre udvikling. Denne protokol er egnet til at inducere mutagenese til analyse af kastespecifik fysiologi og social adfærd hos myrer, men kan også anvendes på et bredere spektrum af hymenopteraner og andre insekter.
Introduction
Udviklingen af eusocialitet hos insekter, nemlig ordenerne Hymenoptera og Blattodea (tidligere Isoptera), har resulteret i unikke og ofte sofistikerede adfærdstræk, der manifesterer sig på både individ- og koloniniveau. Reproduktiv arbejdsdeling, et træk, der karakteriserer de mest avancerede grupper af sociale insekter, involverer ofte kastesystemer sammensat af flere adfærdsmæssige og ofte morfologisk karakteristiske grupper. En sådan adfærdsmæssig og morfologisk mangfoldighed mellem kaster styres ikke kun af deres genetiske system, men også ofte af miljøet 1,2,3,4, hvilket gør eusociale insekter attraktive emner for genetisk og epigenetisk forskning.
Evnen til at manipulere det genetiske system af eusociale insekter har vist sig at være udfordrende, da mange arter ikke parrer sig og reproducerer i laboratoriemiljøer. De fleste eusociale insekter har også meget få reproduktive individer i en koloni, hvilket begrænser antallet af afkom, der kan produceres, og dermed begrænser prøvestørrelsen for genetisk manipulation5. Derudover har mange eusociale insekter lange generationstider sammenlignet med insekter, der almindeligvis anvendes til genetiske undersøgelser (såsom Drosophila), hvilket øger vanskeligheden ved at etablere genetiske linjer5. Nogle eusociale arter kan imidlertid generere en stor andel af reproduktivt aktive individer i en koloni, hvilket lindrer udfordringerne og giver mulighed for at etablere mutante eller transgene linjer.
I tilfælde af ponerinmyrearten, Harpegnathos saltator, kan alle kvindelige arbejdere blive reproduktivt aktive ved en dronnings død eller social isolation. Disse arbejdere kaldes “gamergates” og kan bruges til at generere nye kolonier6. Desuden kan der være mere end en gamergate til stede i en koloni, hvilket øger afkomsproduktionen 5,7,8. Indtil videre er der udviklet mutante og/eller transgene linjer i den europæiske honningbi, Apis mellifera, og i myrearterne H. saltator, Ooceraea biroi og Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiske analyser hos sociale bier og myrer har banet vejen for en bedre forståelse af eusocialitet, hvilket giver en række muligheder for at studere gener og deres indvirkning på eusocial insektadfærd og kastespecifik fysiologi.
Her leverer vi en protokol for genetisk modifikation via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Specifikt blev denne teknik brugt til at generere en kimlinjemutation i orco, genet, der koder for den obligatoriske co-receptor af alle lugtreceptorer (OR’er)10. OR-gener er blevet bemærkelsesværdigt udvidet i hymenopteran eusociale insekter16, og orco spiller en væsentlig rolle i insektolfaction; i mangel heraf samles eller fungerer regionerne i den yderste periferi ikke normalt. Mutationer af orco-genet forstyrrer derfor olfaktorisk fornemmelse, neural udvikling og tilhørende social adfærd 9,10.
I denne protokol indføres Cas9-proteiner og små guide-RNA’er (sgRNA’er) i myrembryoner ved hjælp af mikroinjektion med det formål at inducere mutagenese af et målgen. Her vil vi beskrive mikroinjektionsproceduren i detaljer sammen med anvisninger vedrørende pleje af kolonier og injicerede embryoner. Disse metoder er egnede til at inducere mutagenese i en række forskellige gener i H. saltatormyrer og kan anvendes på et bredere spektrum af hymenopteranske insekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af eusocialitet blandt insekter, herunder myrer, bier, hvepse og termitter, har resulteret i fremkomsten af nye adfærdsmæssige og morfologiske træk, hvoraf mange forstås at være påvirket af en kombination af miljømæssige og genetiske faktorer 1,2,3,4. Desværre er eusociale insekters tiltrækningskraft og anvendelighed som forskningsmodeller inden for genetik blevet hindret …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Danny Reinbergs og Claude Desplans laboratorier ved New York University og Jürgen Liebigs laboratorium ved Arizona State University for deres støtte til myregenetik. Hua Yan anerkender støtte fra National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under Grant No. IIP-1821914 og af industripartnere. Maya Saar blev støttet af United States – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
