माउस मॉडल अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। इस उद्देश्य के लिए, पैच-क्लैंप माप करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स आवश्यक हैं। यहां, प्रतिगामी एंजाइम-आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने की एक विधि, जो कैल्शियम-क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम प्रवाह के एक साथ माप की अनुमति देती है, का वर्णन किया गया है।
माउस मॉडल अतालता अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और परिवर्तित आयन चैनल फ़ंक्शन और कैल्शियम हैंडलिंग सहित अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। इस उद्देश्य के लिए, पैच-क्लैंप माप करने या कैल्शियम हैंडलिंग असामान्यताओं का पता लगाने के लिए उच्च गुणवत्ता के एट्रियल या वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स आवश्यक हैं। हालांकि, वर्तमान अलगाव प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स की सीमित उपज एक ही माउस में दोनों मापों की अनुमति नहीं देती है। यह लेख प्रतिगामी एंजाइम-आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो एक जानवर से कैल्शियम क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम प्रवाह के बाद के माप के लिए है। माउस दिल प्राप्त किए जाते हैं, और रक्त को हटाने के लिए महाधमनी को तेजी से प्रवेशित किया जाता है। फिर दिल को शुरू में कैल्शियम-मुक्त समाधान (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ जोड़ा जाता है ताकि ऊतक को इंटरकैलेटेड डिस्क के स्तर पर अलग किया जा सके और बाद में बाह्य मैट्रिक्स (37 डिग्री सेल्सियस) को बाधित करने के लिए थोड़ा कैल्शियम युक्त एंजाइम समाधान के साथ। पचे हुए दिल को बाद में एट्रिया और वेंट्रिकल्स में विच्छेदित किया जाता है। ऊतक के नमूनों को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है और सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके भंग कर दिया जाता है। एंजाइमेटिक पाचन बंद हो जाता है, और कोशिकाओं को शारीरिक कैल्शियम सांद्रता में चरणबद्ध रूप से पुन: पेश किया जाता है। फ्लोरोसेंट सीए2 + -संकेतक के साथ लोड होने के बाद, पृथक कार्डियोमायोसाइट्स कैल्शियम धाराओं और क्षणिकों के एक साथ माप के लिए तैयार किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, अलगाव के नुकसान पर चर्चा की जाती है और पैच-क्लैंप प्रोटोकॉल और ऊपर वर्णित एट्रियल और वेंट्रिकुलर मुराइन मायोसाइट्स में एक साथ कैल्शियम क्षणिक माप के साथ एल-टाइप कैल्शियम धाराओं के प्रतिनिधि निशान प्रदान किए जाते हैं।
कार्डियक अतालता आम है और वर्तमान प्रमुख स्वास्थ्य चुनौतियों में से एक है क्योंकि वे दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं। अतालता उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 से जुड़ी हुई है और अचानककार्डियक मौतों के बहुमत के लिए अंतर्निहित कारण का प्रतिनिधित्व करती है। अप टू डेट उपचार विकल्पों ने रोगी के अस्तित्व में सुधार किया है, लेकिन अभी भी अंतर्निहित तंत्र को लक्षित करने के बजाय मुख्य रूप से रोगसूचक उपचार हैं। इस प्रकार, इन उपचारों में सीमित प्रभावकारिता होती है और अक्सर गंभीर दुष्प्रभाव 4,5,6 हो सकते हैं। वर्तमान उपचार विकल्पों में सुधार के लिए अंतर्निहित पैथोफिज़ियोलॉजी में अंतर्दृष्टि की आवश्यकता होती है, जिससे अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मॉडल की आवश्यकता होती है। छोटे पशु मॉडल – और विशेष रूप से माउस मॉडल – अतालता अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आयन चैनल फ़ंक्शन या कैल्शियम हैंडलिंग 7,8 पर आनुवंशिक प्रभाव।
इस उद्देश्य के लिए, पर्याप्त मात्रा और व्यवहार्यता के पृथक एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए विभिन्न अलगाव दृष्टिकोणों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम पहले 9,10,11,12,13 वर्णित किया गया है और कुछ समूहों ने एट्रियल 14 या वेंट्रिकुलर 15 से एल-टाइप करंट और कैल्शियम वर्तमान प्रेरित कैल्शियम ट्रांसिएंट्स के एक साथ माप से डेटा प्रस्तुत किया है। मुराइन कार्डियोमायोसाइट्स। हालांकि, हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के लिए एक जानवर से एट्रियल और वेंट्रिकुलर माप का कोई डेटा उपलब्ध नहीं है। शोधकर्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से लेकर प्रोटिओमिक्स तक विभिन्न प्रकार के विषयों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, सेल कॉन्ट्रैक्टिलिटी या प्रोटीन इंटरैक्शन, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन, या जेनेटिक्स के रूप में कार्यात्मक अध्ययन – सभी को पृथक कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। इस प्रकार प्रकाशित प्रोटोकॉल में से कई को विशेष रूप से पैच क्लैंप अध्ययन के लिए विकसित नहीं किया गया है, जिससे पैच क्लैंप अध्ययन के लिए सीमित पैदावार और अपर्याप्त सेल गुणवत्ता होती है। इस प्रकार, एक जानवर से अलग एट्रियल और वेंट्रिकुलर कोशिकाओं के एक साथ पैच क्लैंप और कैल्शियम क्षणिक माप स्थापित प्रोटोकॉल के साथ नहीं किए जा सकते हैं।
पैच क्लैंप प्रयोगों के लिए मुराइन – विशेष रूप से एट्रियल – मायोसाइट्स का अलगाव चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यह लेख प्रतिगामी एंजाइम आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक सरल और तेज़ विधि प्रदान करता है, जो बाद में एक जानवर से शुद्ध झिल्ली प्रवाह और वर्तमान प्रेरित कैल्शियम क्षणिकदोनों के एक साथ माप की अनुमति देता है। यह लेख जंगली प्रकार के चूहों और आनुवंशिक उत्परिवर्तन वाले चूहों से प्राप्त एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल को विस्तृत करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग नर और मादा चूहों के लिए समान रूप से किया जा सकता है। नीचे वर्णित मायोसाइट अलगाव, चित्र और प्रतिनिधि परिणाम 6 (± 1) महीने की उम्र में जंगली प्रकार सी 57बीएल / 6 चूहों से प्राप्त किए गए थे। फिर भी, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न जीनोटाइप के साथ 2 से 24 महीने तक की विभिन्न उम्र में चूहों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। चित्रा 1 एंजाइम छिड़काव के दौरान अलगाव सेटअप और एक कैनुलाटेड दिल के क्लोज-अप को दर्शाता है।
यह लेख एक साथ कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के साथ पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए एक ही माउस से उच्च गुणवत्ता वाले एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स प्राप्त करने का एक आसान और कार्यात्मक तरीका प्रदान करता है?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा समर्थित था; संवहनी चिकित्सा में क्लिनिशियन वैज्ञानिक कार्यक्रम (प्राइम), एमए 2186/14-1 से पी. टॉमसिट्स और डी. शुटलर; वीओ1568/3-1, आईआरटीजी1816, और एसएफबी1002 प्रोजेक्ट ए13 टू एन वोइट, जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ईएक्ससी 2067/1- एन वोइट के 390729940), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस. क्लॉस और एन. वोइट; 81जेड0600206 से एस. के.के.ए.बी.एस. हेनरिक-एंड-लोटे-मुहलफेनज़ल स्टिफटंग (एस क्लॉस के लिए) और एल्स-क्रोनर-फ्रेसेनियस फाउंडेशन (ईकेएफएस 2016_A20 एन वोइट)। पांडुलिपि तैयार करने में फंड र्स की कोई भूमिका नहीं थी।
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
27G cannula | Servoprax | L10220 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
KCl | Merck | 1049360250 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
syringe | Merck | Z683531-100EA | |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |