Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L
Summary
Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.
Abstract
Modelos de camundongos desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias e permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, incluindo função alterada do canal iônico e manipulação de cálcio. Para isso, cardiomiócitos atriais ou ventriculares de alta qualidade são necessários para realizar medidas de patch-clamp ou explorar anormalidades no manuseio do cálcio. No entanto, o rendimento limitado de cardiomiócitos de alta qualidade obtido pelos protocolos de isolamento atuais não permite ambas as medidas no mesmo camundongo. Este artigo descreve um método para isolar miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, para subsequentes medições simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L de um animal. Corações de camundongos são obtidos, e a aorta é rapidamente canulada para remover o sangue. Os corações são então inicialmente perfundidos com uma solução isenta de cálcio (37 °C) para dissociar o tecido ao nível dos discos intercalados e, posteriormente, com uma solução enzimática contendo pouco cálcio para romper a matriz extracelular (37 °C). O coração digerido é posteriormente dissecado em átrios e ventrículos. As amostras de tecido são picadas em pequenos pedaços e dissolvidas por pipetagem cuidadosa para cima e para baixo. A digestão enzimática é interrompida e as células são gradualmente reintroduzidas nas concentrações fisiológicas de cálcio. Após o carregamento com um indicador fluorescente de Ca2+, os cardiomiócitos isolados são preparados para a medição simultânea de correntes de cálcio e transientes. Além disso, armadilhas de isolamento são discutidas e protocolos de patch-clamp e traços representativos de correntes de cálcio do tipo L com medidas simultâneas de transientes de cálcio em miócitos murinos atriais e ventriculares isolados como descrito acima são fornecidos.
Introduction
As arritmias cardíacas são comuns e um dos grandes desafios atuais para a saúde, uma vez que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. As arritmias estão associadas a alta morbidade e mortalidade 1,2 e representam a causa básica da maioria das mortes súbitas cardíacas3. As opções de tratamento atualizadas melhoraram a sobrevida do paciente, mas ainda são principalmente tratamentos sintomáticos em vez de visar os mecanismos subjacentes. Assim, esses tratamentos têm eficácia limitada e podem frequentemente causar efeitos colaterais graves 4,5,6. Uma melhoria das opções de tratamento atuais requer informações sobre a fisiopatologia subjacente, criando a necessidade de modelos adequados para estudo. Modelos de pequenos animais – e especificamente modelos de camundongos – desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias, pois permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, por exemplo, o impacto genético na eletrofisiologia celular, na função dos canais iônicos ou no manuseio do cálcio 7,8.
Para isso, são necessários cardiomiócitos atriais e ventriculares isolados em quantidade e viabilidade suficientes. Um amplo espectro de diferentes abordagens de isolamento para obtenção de miócitos atriais e ventriculares foi previamente descrito9,10,11,12,13 e alguns grupos apresentaram dados de medidas simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente L e pela corrente de cálcio do átrio 14 ou ventricular15 cardiomiócitos murinos. No entanto, até onde sabemos, não há dados disponíveis de medidas atriais e ventriculares de um animal. Os pesquisadores se concentram em uma ampla variedade de tópicos que vão desde eletrofisiologia até proteômica, estudos funcionais como contratilidade celular ou interações proteicas, função mitocondrial ou genética – todos precisando de cardiomiócitos isolados. Muitos dos protocolos publicados, portanto, não foram desenvolvidos especificamente para estudos de patch clamp, levando a rendimentos limitados e qualidade celular insuficiente para estudos de patch clamp. Assim, medidas simultâneas de patch clamp e transiente de cálcio de células atriais e ventriculares isoladas de um animal não podem ser realizadas com protocolos estabelecidos.
O isolamento de miócitos murinos – especialmente atriais – para experimentos de patch clamp permanece desafiador. Este artigo fornece um método simples e rápido para o isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que subsequentemente permite medições simultâneas de transientes de cálcio induzidos pela corrente líquida e corrente de um animal. Este artigo elabora um protocolo para o isolamento de miócitos atriais e ventriculares derivados de camundongos selvagens e portadores de mutações genéticas. Este protocolo pode ser usado para camundongos machos e fêmeas. O isolamento de miócitos, as imagens e os resultados representativos descritos abaixo foram obtidos de camundongos selvagens C57Bl/6 com idade de 6 (± 1) meses. No entanto, este protocolo tem sido utilizado com sucesso em camundongos em várias idades variando de 2 a 24 meses com diferentes genótipos. A Figura 1 mostra o arranjo de isolamento e o close-up de um coração canulado durante a perfusão enzimática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo fornece uma maneira fácil e funcional de obter miócitos atriais e ventriculares de alta qualidade do mesmo camundongo para estudos de patch-clamp com registros simultâneos de transientes de cálcio. A qualidade dos dados obtidos depende muito da qualidade do isolamento celular. Como mencionado acima, vários métodos para isolar cardiomiócitos murinos foram descritos previamente9,10,11,12.<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; Cientista Clínico do Programa de Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 para P. Tomsits e D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 e SFB1002 projeto A13 a N. Voigt), Fundação Alemã de Pesquisa no âmbito da Estratégia de Excelência da Alemanha (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss e N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), a Fundação Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), a ERA-NET sobre Doenças Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), a Fundação Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl (a S. Clauss) e a Fundação Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
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