Summary
小鼠模型允许研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞来进行膜片钳测量。这里描述了一种通过逆行基于酶的Langendorff灌注分离鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法允许同时测量钙瞬变和L型钙电流。
Abstract
小鼠模型在心律失常研究中起着至关重要的作用，并允许研究心律失常发生的关键机制，包括离子通道功能的改变和钙处理。为此，需要高质量的心房或心室心肌细胞来进行膜片钳测量或探索钙处理异常。然而，通过当前分离方案获得的高质量心肌细胞的有限产量不允许在同一只小鼠中进行两次测量。本文描述了一种通过逆行基于酶的Langendorff灌注分离高质量鼠心房和心室肌细胞的方法，以便随后同时测量一只动物的钙瞬变和L型钙电流。获得小鼠心脏，并迅速插管主动脉以去除血液。然后首先用无钙溶液（37°C）灌注心脏以在插层盘水平上解离组织，然后用含有少量钙的酶溶液破坏细胞外基质（37°C）。消化的心脏随后被解剖成心房和心室。将组织样品切成小块，并通过小心地上下移液溶解。停止酶消化，并逐步将细胞重新引入生理钙浓度。用荧光Ca2+指示剂加载后，制备分离的心肌细胞，用于同时测量钙电流和瞬变。此外，还讨论了隔离陷阱，并提供了膜片钳方案和L型钙电流的代表性迹线，同时在如上所述分离的心房和心室鼠肌细胞中进行钙瞬时测量。
Introduction
心律失常很常见，也是当前主要的医疗保健挑战之一，因为它们影响着全球数百万人。心律失常与高发病率和死亡率有关1，2，是大多数心脏性猝死的根本原因3。最新的治疗方案提高了患者的生存率，但仍然主要是对症治疗，而不是针对潜在的机制。因此，这些治疗的疗效有限，并且可能经常引起严重的副作用4，5，6。当前治疗方案的改进需要深入了解潜在的病理生理学，从而需要合适的模型进行研究。小动物模型 - 特别是小鼠模型 - 在心律失常研究中起着至关重要的作用，因为它们可以研究心律失常发生的关键机制，例如对细胞电生理学，离子通道功能或钙处理的遗传影响7，8。
为此，需要足够数量和活力的孤立心房和心室心肌细胞。先前已经描述了获得心房和心室肌细胞的广谱不同分离方法9，10，11，12，13，并且一些小组提供了同时测量来自心房14或心室15的L型电流和钙电流诱导的钙瞬变的数据鼠心肌细胞。然而，据我们所知，没有一种动物的心房和心室测量数据。研究人员专注于各种各样的主题，从电生理学到蛋白质组学，细胞收缩力或蛋白质相互作用的功能研究，线粒体功能或遗传学 - 所有这些都需要分离的心肌细胞。因此，许多已发表的方案尚未专门针对膜片钳研究开发，导致膜片钳研究的产量有限且细胞质量不足。因此，不能使用既定的方案对从一只动物分离的心房和心室细胞同时进行膜片钳和钙瞬时测量。
分离鼠（尤其是心房）肌细胞进行膜片钳实验仍然具有挑战性。本文提供了一种简单快速的方法，通过基于逆行酶的Langendorff灌注分离高质量的鼠心房和心室肌细胞，随后可以同时测量一只动物的净膜电流和电流诱导的钙瞬变。本文详细阐述了分离来自野生型小鼠和携带基因突变的小鼠的心房和心室肌细胞的方案。该协议可用于雄性和雌性小鼠。下面描述的肌细胞分离，图像和代表性结果是从6（±1）个月大的野生型C57Bl / 6小鼠中获得的。然而，该方案已成功用于具有不同基因型的2至24个月不同年龄的小鼠。 图1 显示了酶灌注过程中分离设置和空心的特写。
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Protocol
所有动物程序均由下萨克森州动物审查委员会（LAVES，AZ-18/2900）批准，并按照所有机构，国家和国际动物福利指南进行。
1. 预先安排
- 准备 1 L 10x 灌注缓冲液（表 1）、500 mL 1x 灌注缓冲液（表 2）、50 mL 消化缓冲液（表 3）、10 mL 终止缓冲液（表 4）、1 L Tyrode 溶液（表 5）、10 mL 每个钙阶梯溶液（含葡萄糖和相应钙量的 Tyrode 溶液，如所示）， 根据提供的配方，1 L 4-AP 溶液（表 5）、100 mL 移液器溶液（表 6）和 5 mL 普鲁龙酸。
注意：可以提前制备浴溶液（Tyrode和4-AP溶液）（不含葡萄糖）并储存在+ 4°C，在实验日加入葡萄糖。移液器溶液可储存在-20°C，在实验当天加入钙指示剂，然后将溶液储存在冰上直至进一步使用。10x灌注缓冲液可在室温下储存，1x灌注缓冲液，消解缓冲液和停止缓冲液应在实验当天新鲜制备。 - 打开水浴和滚筒泵。
- 用灌注缓冲液预填充朗根多夫装置;确保它是无空气的。
- 通过将主动脉套管固定在解剖显微镜下来制备主动脉套管，用装有灌注缓冲液的 1 mL 注射器连接，并通过冲洗套管来清洁空气。
注意：避免灌注系统内有任何空气至关重要，因为这将直接影响冠状动脉灌注，从而影响消化效果。如有必要，可以在设置中添加气泡捕集器，以安全地避免任何空气滞留。 - 用足够的灌注缓冲液准备培养皿，用于器官收集和显微镜检查（缓冲液应牢固地覆盖整个器官，几毫升 - 取决于使用的培养皿大小 - 应该足够）。
- 用消化缓冲液准备3个培养皿，用于组织解离和显微镜检查，缓冲液应覆盖器官，以便在相应的培养皿内的显微镜下解剖，数量取决于使用的培养皿大小。对于解离，心室组织使用 3 mL，心房组织使用 1.5 mL。
2. 摘取器官
- 使用带有27G套管的1mL注射器将小鼠与0.1mL肝素（1，000U / mL）腹腔注射，并等待5-10分钟。
- 将小鼠与浸泡在约500μL异氟醚中的小组织一起放入诱导室中。动物不应与组织接触。为了避免这种情况，可以使用塑料活检包埋盒来覆盖组织。一旦动物完全麻醉，检查脚趾捏反射，一旦它不再存在，就通过颈椎脱位迅速对小鼠实施安乐死。
- 将鼠标放在其背部的平台上（例如，在用纸巾覆盖的聚苯乙烯泡沫塑料上），并用套管固定爪子以将其固定到位。
- 用剪刀从颈静脉向联合的清晰切口去除覆盖胸部和部分腹部的皮毛和皮肤，并在剑突下方打开腹部，而不会伤害任何器官结构。用手术钳抬起胸骨，用剪刀沿着肋骨边缘剪断横膈膜，然后在腋窝内侧线切割肋骨并取出肋骨以露出心脏。
- 使用钝钳小心地取出心包，并通过用钝钳从下方提起心脏并用剪刀一次切割大血管来快速取出心脏。
- 将心脏放入室温灌注缓冲液中，并在显微镜下尽快用钝端针插管主动脉。
注意：去除附着在器官上的任何肺组织和脂肪组织，而不会在其上浪费太多时间。插管时，请确保针头末端不会穿过主动脉瓣，因为这会阻止缓冲液进入冠状动脉，从而损害结果。 - 用一块缝合丝将心脏牢固地绑在针头上，然后断开注射器。
注意：从获得心脏（大血管被切断的那一刻）到将主动脉缝合到针头上的整个过程应花费尽可能少的时间。建议从取出心脏到开始灌注的时间不要超过90-180秒。
3. 酶消化
- 主动脉插管后，立即将空心连接到朗根道夫装置，避免任何空气进入系统。
注意：在Langendorff装置的底部悬挂一滴灌注缓冲液，并在针头顶部放置一滴灌注缓冲液，以避免任何空气进入系统，这很有帮助。 - 在正好37°C的温度和恰好4mL / min的灌注速率下用灌注缓冲液灌注心脏1分钟。
注意：为了使灌注针尖的温度为37°C，水浴温度必须设置为略高于约40°C。 应通过测量灌注尖端的温度来定期测试。 - 将灌注切换到消化缓冲液并在正好 37 °C 的温度和正好 4 mL/min 的灌注速率下灌注正好 9 分钟。
- 将消化的心脏转移到具有足够消化缓冲液的培养皿中，以使其完全覆盖。然后在显微镜下仔细解剖心房和心室。
- 将心房转移到装有 1.5 mL 消化缓冲液的培养皿中，将心室转移到另一个装有 3 mL 消化缓冲液的培养皿中。
- 心房夹层
- 小心地，但不浪费时间，使用钝钳将心房拉开成小块。
- 使用 1，000 μL 移液器吸头小心地上下移液来溶解组织，该吸头之前已被切割以扩大吸头开口。
- 将溶液转移到 15 mL 离心管中，并通过小心地从管侧面移液以结束反应，加入等量的终止缓冲液 （1.5 mL）。
- 小心地将所有 3 mL 细胞/组织溶液通过 200 μm 尼龙网，以去除尚未完全消化的剩余较大组织碎片。
注意：成功的消化几乎不会留下任何固体块。
- 心室夹层
- 使用解剖剪刀快速将心室组织切成小块，上下移液以溶解。使用另一个 1，000 μL 移液器吸头上下移液，可以缩短以扩大开口。
- 将细胞/组织溶液转移到 15 mL 离心管中，并通过小心地从管侧面移液以结束反应，加入等量的终止缓冲液 （3 mL）。
- 小心地将所有 6 mL 细胞/组织溶液通过 200 μm 尼龙网，以去除尚未完全消化的较大组织碎片。
注意：成功的消化几乎不会留下任何固体块。
- 将两个管（心房和心室细胞悬液）在室温下在工作台上放置6分钟以沉淀。
- 将两个 15 mL 管以 5 x g 离心 2 分钟。
4. 钙再引入
注意：以下步骤对于心房和心室细胞（除非另有说明）是相同的，并且在室温下进行。
- 使用塑料巴斯德移液管弃去上清液，并小心地将沉淀重悬于10mL无钙Tyrode溶液中。
- 让细胞沉降8分钟。
- 以5× g 离心1分钟（仅心房细胞，沉降足以用于心室细胞）。
- 弃去上清液，小心地将沉淀重悬于100μM钙浓度的10mL Tyrode溶液中。
- 让细胞沉降8分钟。
- 以5× g 离心1分钟（仅心房细胞，沉降足以用于心室细胞）。
- 弃去上清液，小心地将沉淀重悬于10mL钙浓度为400μM的Tyrode溶液中。
- 让细胞沉降8分钟。
- 以5× g 离心1分钟（仅心房细胞，沉降足以用于心室细胞）。
- 弃去上清液，小心地将沉淀重悬于1mL（心房）/ 5mL（心室）的Tyrode溶液中，钙浓度为1mM。
5.用荧光钙指示剂Fluo-3 AM加载肌细胞
注意：由于荧光钙指示剂的光敏性，应执行以下步骤，避光（例如，用铝箔覆盖管）。
- 通过将 44 μL 20% 多朗 F-127 无水 DMSO 添加到 50 μg Fluo-3AM 中（可在避光下储存在 -20 °C 中）来制备 Fluo-3 AM 储备溶液。
- 将 10 μL Fluo-3 AM 储备溶液加入 1 mL 细胞悬液中，并在室温避光下孵育 10 分钟。
- 以5× g 离心1分钟。
- 使用塑料巴斯德移液管弃去上清液，并将沉淀重悬于合理量的浴液中，以获得良好的工作浓度（1-5mL浴液，取决于细胞密度）。
- 在开始实验之前，静置30分钟进行脱酯。
6. 如前所述同时膜片钳和落射荧光 Ca2+ 瞬态测量16
注意：膜片钳测量不是本文的主题，感兴趣的读者可以参考主要出版物，其中提供了该方法的深入描述17，18，19，20，21，22。然而，为了更好地理解，提供了测量L型钙电流以及电流诱导的钙瞬变的协议摘要。
- 将肌细胞转移到细胞室中，并在37°C下用浴液过度融合。
- 如 表5所示，通过在浴液中加入4-氨基吡啶和氯化钡来阻断钾电流。
- 确保硼硅酸盐微电极的尖端电阻为2-5 MΩ，填充有移液器溶液（表6）。
- 设置测量以允许同时记录电信号和落射荧光。电压钳位模式用于测量 L 型Ca 2+ 电流，协议将电池保持在 -80 mV，600 ms 斜坡脉冲保持在 -40 mV 以停用快速 Na+ 电流，然后在 0.5 Hz 时将 100 ms 测试脉冲保持在 +10 mV（图 2）。
- 使用488 nm处的激发，在<520 nm处发射的光进行检测并转换为[Ca2+]I 假设
其中 kd = Fluo-3的解离常数（864 nM）， F = Fluo-3荧光; Fmax = 在每个实验结束时获得的Ca 2+ 饱和荧光19.
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Representative Results
通过将 10 μL 细胞悬液移液到显微镜载玻片上，在重新引入钙后确定分离产量。超过 100 个活的杆状非收缩细胞/10 μL 用于心房细胞分离和超过 1，000 个活的杆状、非收缩细胞/10 μL 用于心室细胞分离被认为是足够的产量，并且通常使用此协议获得。通过该方案获得的心房细胞显示出各种不同的细胞类型，其中包含心脏传导系统的细胞，特别是窦房结，以及来自左右心房以及心耳的不同肌细胞。由于这些区域没有单独解剖，因此会产生各种细胞形态。所有心房细胞都很小，细胞电容范围约为 35 pF– 100 pF，有些比其他的更丝状。 图3 图A显示了来自装有钙敏感染料的心房工作心肌的典型细胞，准备用于使用此协议获得的测量。心室心肌细胞更棒状且更大，细胞电容范围为100至400 pF左右， 图3 面板B显示了来自负载有钙敏感染料的工作心肌的典型心室细胞，准备通过该协议获得测量。图4显示了L型钙电流测量的代表性示例，同时来自一个心房肌细胞（图B和C）和一个心室心肌细胞（ 图 E和F）的胞质钙瞬变。
图 1：朗根多夫装置。 （A） 隔离装置的照片，包括定制设计的热交换器和夹套心室。（B）夹克心室的特写，心脏空心就位。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：刺激方案。 电压钳协议（0.5 Hz）用于测量总净膜电流（IM），主要反映L型Ca 2+电流和Ca 2+电流感应Ca 2+瞬态。请点击此处查看此图的大图。
图3：分离的小鼠心肌细胞。 （A）装有Fluo-3的心房心肌细胞的示例，准备进行膜片钳实验。（B）加载Fluo-3的心室心肌细胞的示例，准备进行膜片钳实验。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：代表性录音。 （A） 电压钳位协议 （0.5 Hz）。（B）总净膜电流（IM），主要反映小鼠心房心肌细胞中的L型Ca2+电流。（C）L型Ca 2+电流触发小鼠心房肌细胞中的Ca2+瞬时。（D） 电压钳位协议 （0.5 Hz）。（E）总净膜电流（IM），主要反映小鼠心室肌细胞中的L型Ca2+电流。（F）L型Ca 2+电流触发小鼠心室心肌细胞中的Ca2+瞬时。请点击此处查看此图的大图。
| 最终浓度（毫米） | |
| 氯化钠 | 120.4 |
| 氯化钾 | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na2HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| 氧化镁4 x 7H2O | 1.2 |
| 赫佩斯 | 10 |
表 1：10x 灌注缓冲液 （1，000 mL）。
| 最终浓度（毫米） | |
| 氢氧化钠3 | 4.6 |
| 牛磺酸 | 30 |
| 2，3-丁二酮单肟 | 10 |
| 葡萄糖 | 5.5 |
| 10x 灌注缓冲液 | 50毫升 |
| 双蒸馏 H2O （18，2 MΩ-cm） | 500毫升 |
表 2：1x 灌注缓冲液 （500 mL）。
| 最终浓度 | |
| II型胶原酶 | ~600 U/毫升 |
| 氯化钙2 | 40微米 |
| 1x 灌注缓冲液 | 50毫升 |
表 3：消化缓冲液 （50 mL）。
| 最终浓度 | |
| 牛犊精华 | 10% |
| 氯化钙2 | 12.5微米 |
| 1x 灌注缓冲液 | 10毫升 |
表 4：终止缓冲液（10 mL）。
| 最终浓度（毫米） | ||
| 泰罗德 | 4-AP | |
| 氯化钠 | 140 | 140 |
| 赫佩斯 | 10 | 10 |
| 葡萄糖 | 10 | 10 |
| 氯化钾 | 4 | 4 |
| 氯化镁 x 6H2O | 1 | 1 |
| 丙磺舒 | 2 | 2 |
| 4-氨基吡啶 | 5 | |
| 氯化钝2 | 0.1 | |
| 氯化钙2 | 1 | 1 |
| 酸碱度 | 7.35在室温下用1M NaOH调节 | 7.35在室温下用1M NaOH调节 |
表5：浴液。
| 最终浓度（毫米） | |
| DL-天冬氨酸K+盐 | 92 |
| 氯化钾 | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| 埃格塔 | 0.02 |
| 鸟苷5′-三磷酸三盐 | 0.1 |
| 赫佩斯 | 10 |
| 氟-3 | 0.1 |
| 酸碱度 | 7.20 在室温下用 1 M KOH 调节 |
表6：移液器溶液。
| 观察到的问题 | 可能的原因 | 溶液 |
| 细胞产量低，组织块残留 | 消化不足 | 以 15 秒为增量增加消解时间 |
| 细胞产量低，组织块残留 | 消化不足 | 以 50 U/ml 为步长增加胶原酶量 |
| 过度消化和消化不足的细胞混合，留下组织块 | 无冠状动脉灌注 | 确保不要将主动脉插管插入心室 |
| 过度消化和消化不足的细胞混合，留下组织块 | 气泡 | 确保不要将任何空气插入灌注系统 |
| 整体细胞质量低 | 缺血时间过长 | 减少缺血时间，考虑替代方法以尽可能长时间地维持血液循环 |
表 7：常见问题以及如何解决这些问题。
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Discussion
本文提供了一种简单实用的方法来从同一只小鼠获得高质量的心房和心室肌细胞，用于膜片钳研究，同时进行钙瞬时记录。所获得数据的质量在很大程度上取决于细胞分离的质量。如上所述，许多分离小鼠心肌细胞的方法已在前面描述9，10，11，12。分离的细胞用于各种分析，从膜片钳实验到收缩力研究、形态学研究、蛋白质组学、线粒体功能研究等等。每个单独的目的都需要以不同的方式优化分离的细胞。因此，没有一个方案导致适用于膜片钳实验的高质量分离，同时测量一只小鼠心房和心室肌细胞的钙处理特性。为了改变这一点，前面描述的众多协议的适应导致了该协议的开发。有些步骤在机械上具有挑战性，有些步骤需要以特定的方式完成，有些步骤对隔离质量至关重要。下面将讨论这些步骤。
细胞分离的产量和质量随着动物年龄的增长而降低，可能是由于组织纤维化增加11，23，24使得需要单独调整消化时间和酶量。动物年龄越大，预期的纤维化组织就越多。指示的消化时间和酶量对于6个月大的正常大小的健康小鼠来说是一个很好的起点，但需要适应个体需求。建议在使用老年小鼠或有利于纤维化的转基因小鼠时应用更多的酶和更长的消化时间。正如以前的工作所强调的那样，快速和无空气的插管以及心脏的立即灌注对于良好的细胞质量绝对至关重要11。建议从获得心脏并将其放入室温灌注缓冲液中到开始灌注的时间不超过 90-180 秒——越快越好。将所有需要的设备设置在一个房间中以避免长距离是有帮助的。如果需要进一步缩短缺血间隔，可以使用另一种麻醉和随后的安乐死方法。如上所述完全麻醉动物，腹腔涂抹足量的芬太尼（或根据您的动物福利指南等效的镇痛药物），并将动物移动到带有异氟烷蒸发器和适合小鼠的麻醉面罩的平台，提供恒定的异氟烷和氧气流动。然后按上述操作。由于动物在单次切割断开大血管之前具有正常的循环，因此该方法将显着减少无流动时间，从而在需要时可以提高隔离质量。
摘取心脏后，将主动脉套管放置在正确的深度以确保冠状动脉灌注至关重要。因此，在切除心脏时，有必要在主动脉弓或主动脉后部切开主动脉，以留下至少 5 mm 的主动脉进行插管，从而将缝合丝从冠状动脉远端绑住，但在第一主动脉侧分支之前。
在分离过程中，需要多次细胞转移，使用小移液器吸头移液会对细胞产生高剪切应力。减少剪切应力的可能解决方案是缓慢而小心地移液，以及以45°角将移液器吸头切割几毫米以扩大吸头开口。通过熔化切割的移液器吸头以软化边缘，可以进一步降低剪切应力。心室隔离的隔离产量通常非常高，因此不必降低剪切应力。根据个人目标，将心室细胞暴露在剪切应力下以选择“适者”细胞甚至可能更有用。然而，对于心房隔离，这个过程至关重要，因为心房细胞在消化后特别脆弱。每当添加溶液时，建议避免直接移液到细胞上，而是尝试在管壁上缓慢移液。
胶原酶的选择将显著影响分离结果。由于酶制剂不仅存在差异，而且酶活性也存在相关的批次间差异，因此在开始使用新一批酶或新小鼠品系时，需要滴定胶原酶量和消化时间。但是，上表中指示的数量和时间标志着单个优化的良好起点9.大多数公司提供小酶样品来测试单个批次，这使得批次选择更加方便。
如果像Voigt等人之前描述的那样在不使用EGTA25的情况下分离细胞，则可以获得具有典型振幅和正常单相衰减的钙瞬变9，16。因此，该方案使用低钙浓度，并在分离过程中避免EGTA。为了保护细胞免受Ca2+悖论现象26的影响，逐步缓慢地重新引入钙，直到最终浓度为1mM。由于细胞内钠浓度较高，啮齿动物心肌细胞特别容易钙超负荷，缓慢和逐步重新引入至关重要27。对无钙溶液的需求是所有基于Langendorff的啮齿动物心肌细胞分离的主要限制之一。钙的重新引入总是导致活细胞的显着损失。然而，如此处描述的缓慢和逐步重新引入，导致足够的产量和良好的质量，以可靠地获得每只动物的测量值。
在重新引入钙后立即评估细胞产量和质量非常重要。虽然最终评估是在修补分离的细胞时进行的，但在用钙敏感染料加载细胞之前，人们已经可以通过在显微镜下观察来判断细胞的数量和质量。优质细胞呈杆状，膜均匀且无收缩。收缩是细胞质量低下的标志，因为它表明膜完整性的丧失，可能是由过度消化或施加高剪切应力引起的。过度消化的另一个迹象是 - 除了与活细胞相关的许多细胞阴影 - 一个过于漂亮的膜，已经清除了许多表面蛋白质，当人们试图用移液器尖端接近细胞以形成密封时，它非常脆弱。示例性健康、优质细胞如图 3所示。（图A：心房肌细胞，图B：心室心肌细胞）。高产量的分离可以使细胞对密封形成免疫，反之亦然。最后，无论细胞外观和产量如何，最终的质量测试都是一个简单的问题的答案：“是否有可能在每次分离的分离细胞中以高质量的结果进行所需的测量？上面提供的协议使肯定的答案成为可能。
许多分离方案使用解偶联剂布比他汀来获得更高的产量和更高质量的细胞。该方案故意避免使用布莱比他汀，考虑到其在光学映射实验中对心脏电生理学28，29 影响的已发表证据。在电生理学检查中使用解偶联剂必须谨慎对待，并应仅限于必须解偶联的情况。
用该方案获得的细胞可以在加载Fluo-3后使用约六个小时，心房细胞更容易受到时间的影响。因此，如果同一研究人员处理心房细胞，建议先研究心房细胞，然后再研究心室细胞。
该协议的一个局限性 - 就像大多数基于Langendorff的隔离协议一样 - 是它在技术上很困难。显然，老鼠的心脏很小，所有技术方面都需要大量的锻炼。这意味着经验丰富的研究人员将获得更好的结果。一些方案使用恒定的压力来灌注心脏。这样做的好处是，由于消化和组织阻力的连续丧失，灌注会加速，这有助于确定最佳消化时间，但加速会损害组织并显着降低细胞质量。在这里使用的恒定流动方法中，消解时间没有明确的基准，通常很难在最佳时间停止消解，这标志着相关的限制。另一个限制是，在该协议中，仅测试分离的细胞是否适合上述实验。这些细胞也可能用于不同的分析，但这仍然必须得到证明。朝着这个方向迈出的第一步是使用该细胞通过加载VF2.1CI来可视化动作电位，VF2.1CI是一种最近衍生的电压敏感染料，根据Seibertz等人发表的协议，具有优于以前使用的电压敏感染料的动力学30。为了帮助排除故障， 表 7 显示了常见的隔离问题以及如何解决这些问题。
综上所述，所描述的分离方案提供了一种同时分离小鼠心房和心室心肌细胞的工作方法，使研究人员能够获得单只小鼠的心房和心室电生理表型。这消除了以前的隔离方案造成的统计障碍，这些方案仅以高质量分离心房或心室细胞，并有助于减少特定研究所需的动物数量。如果干预措施（例如植入充满昂贵药物的渗透微型泵）是实验的一部分，并且这可能是动物福利考虑的重要因素，则这一点尤其重要。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会（DFG;血管医学临床科学家计划（PRIME），MA 2186/14-1至P. Tomsits和D. Schüttler;VO1568/3-1、IRTG1816 和 SFB1002 项目 A13 至 N. Voigt）、德国卓越战略下的德国研究基金会（EXC 2067/1- 390729940 至 N. Voigt）、德国心血管研究中心（DZHK;81X2600255 至 S. Clauss 和 N. Voigt;81Z0600206 至 S. Kääb）、科罗纳基金会（S199/10079/2019 至 S. Clauss）、ERA-NET 心血管疾病（ERA-CVD; 01KL1910 至 S. Clauss）， Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung（致S. Clauss）和Else-Kröner-Fresenius基金会（EKFS 2016_A20致N. Voigt）。资助者在手稿准备中没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
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