Isolering av høykvalitets murine atrielle og ventrikulære myocytter for samtidige målinger av ca2+ transienter og L-type kalsiumstrøm

Summary

Musemodeller tillater å studere viktige mekanismer for arytmogenese. Til dette formål er kardiomyocytter av høy kvalitet nødvendig for å utføre patch-klemmemålinger. Her beskrives en metode for å isolere murine atrielle og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbasert Langendorff-perfusjon, som muliggjør samtidige målinger av kalsiumtransienter og L-type kalsiumstrøm.

Abstract

Musemodeller spiller en avgjørende rolle i arytmiforskning og tillater å studere viktige mekanismer for arytmogenese, inkludert endret ionkanalfunksjon og kalsiumhåndtering. For dette formål er atrielle eller ventrikulære kardiomyocytter av høy kvalitet nødvendige for å utføre patch-klemmemålinger eller for å utforske kalsiumhåndteringsavvik. Det begrensede utbyttet av kardiomyocytter av høy kvalitet oppnådd av gjeldende isolasjonsprotokoller tillater imidlertid ikke begge målinger i samme mus. Denne artikkelen beskriver en metode for å isolere høykvalitets murine atrielle og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbasert Langendorff-perfusjon, for påfølgende samtidige målinger av kalsiumtransienter og L-type kalsiumstrøm fra ett dyr. Musehjerter oppnås, og aorta kanyleres raskt for å fjerne blod. Hjerter blir deretter først perfundert med en kalsiumfri løsning (37 °C) for å dissosiere vevet på nivå med interkalerte skiver og deretter med en enzymløsning som inneholder lite kalsium for å forstyrre ekstracellulær matriks (37 °C). Det fordøyede hjertet blir deretter dissekert i atrier og ventrikler. Vevsprøver hakkes i små biter og oppløses ved forsiktig pipettering opp og ned. Den enzymatiske fordøyelsen stoppes, og cellene gjeninnføres trinnvis til fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner. Etter lasting med en fluorescerende Ca²⁺-indikator fremstilles isolerte kardiomyocytter for samtidig måling av kalsiumstrømmer og transienter. I tillegg diskuteres isolasjonsfallgruver, og patch-clamp-protokoller og representative spor av L-type kalsiumstrømmer med samtidige kalsiumforbigående målinger i atrielle og ventrikulære murine myocytter isolert som beskrevet ovenfor er gitt.

Introduction

Hjertearytmier er vanlige og en av dagens store helseutfordringer siden de påvirker millioner av mennesker over hele verden. Arytmier er assosiert med høy morbiditet og mortalitet ^1,2 og representerer den underliggende årsaken til flertallet av plutselige hjertedødsfall³. Oppdaterte behandlingsalternativer har forbedret pasientoverlevelsen, men er fortsatt hovedsakelig symptomatiske behandlinger i stedet for å målrette mot de underliggende mekanismene. Dermed har disse behandlingene begrenset effekt og kan ofte forårsake alvorlige bivirkninger ^4,5,6. En forbedring av dagens behandlingstilbud krever innsikt i den underliggende patofysiologien, noe som skaper behov for egnede modeller å studere. Små dyremodeller – og spesielt musemodeller – spiller en avgjørende rolle i arytmiforskning, da de tillater å studere viktige mekanismer for arytmogenese, for eksempel den genetiske effekten på cellulær elektrofysiologi, ionkanalfunksjon eller kalsiumhåndtering ^7,8.

Til dette formål kreves isolerte atrielle og ventrikulære kardiomyocytter med tilstrekkelig mengde og levedyktighet. Et bredt spekter av ulike isolasjonstilnærminger for å oppnå atrie- og ventrikulære myocytter er tidligere beskrevet 9,10,11,12,13 og noen grupper har presentert data fra samtidige målinger av L-type strøm og kalsiumstrøminduserte kalsiumtransienter fra enten atriell 14 eller ventrikkel ¹⁵ murine kardiomyocytter. Så vidt vi vet finnes det imidlertid ingen data om både atrie- og ventrikkelmålinger fra ett dyr. Forskere fokuserer på et bredt spekter av emner som spenner fra elektrofysiologi til proteomikk, funksjonelle studier som cellekontraktilitet eller proteininteraksjoner, mitokondriell funksjon eller genetikk – alt med behov for isolerte kardiomyocytter. Mange av de publiserte protokollene er derfor ikke spesifikt utviklet for patch clamp-studier, noe som fører til begrenset utbytte og utilstrekkelig cellekvalitet for patch clamp-studier. Samtidig måling av patchklemme og kalsiumforbigående målinger av atrie- og ventrikkelceller isolert fra ett dyr kan derfor ikke utføres med etablerte protokoller.

Isolering av murine – spesielt atrielle – myocytter for patch clamp eksperimenter er fortsatt utfordrende. Denne artikkelen gir en enkel og rask metode for isolering av høykvalitets murine atrielle og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbasert Langendorff-perfusjon, som deretter tillater samtidige målinger av både netto membranstrøm og strøminduserte kalsiumtransienter fra ett dyr. Denne artikkelen utdyper en protokoll for isolering av atrielle og ventrikulære myocytter avledet fra mus av vill type og mus som bærer genetiske mutasjoner. Denne protokollen kan brukes til både mannlige og kvinnelige mus. Myocyttisoleringen, bilder og representative resultater beskrevet nedenfor ble oppnådd fra villtype C57Bl/6-mus i en alder av 6 (± 1) måneder. Likevel har denne protokollen blitt brukt til mus i ulike aldre fra 2 til 24 måneder med forskjellige genotyper. Figur 1 viser isolasjonsoppsett og nærbilde av kanylert hjerte under enzymperfusjon.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Niedersachsen Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) og ble utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for dyrevelferd. 1. Forhåndsordninger Klargjør 1 l 10x perfusjonsbuffer (tabell 1), 500 ml 1x perfusjonsbuffer (tabell 2), 50 ml fordøyelsesbuffer (tabell 3), 10 ml stoppbuffer (tabell 4), 1 liter tyrodeoppløsning (tabell 5), 10 ml av hver kalsiumtr…

Representative Results

Isolasjonsutbyttet bestemmes etter kalsiumgjeninnføring ved å pipetere 10 μL cellesuspensjon på et mikroskoplysbilde. Mer enn 100 levedyktige, stavformede, ikke-kontraherende celler / 10 μL for atriecelleisolasjon og mer enn 1000 levedyktige, stavformede, ikke-kontraherende celler / 10 μL for ventrikulær celleisolasjon anses som tilstrekkelig utbytte og oppnås vanligvis ved bruk av denne protokollen. Atrieceller oppnådd med denne protokollen viste en rekke forskjellige celletyper som inneholder celler i hjertele…

Discussion

Denne artikkelen gir en enkel og funksjonell måte å oppnå atrie- og ventrikulære myocytter av høy kvalitet fra samme mus for patch-clamp-studier med samtidige kalsiumtransientopptak. Kvaliteten på de oppnådde dataene avhenger sterkt av kvaliteten på celleisolasjonen. Som nevnt ovenfor er det tidligere beskrevet mange metoder for å isolere murine kardiomyocytter 9,10,11,12. De isolerte …

Materials

2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	31550
27G cannula	Servoprax	L10220
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	A78403
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
Aortic cannula	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
blunt surgical forceps	Kent Scientific	INS650915-4
Bovine Calf Serum	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750
Circulating heated water bath	Julabo	ME
Collagenase Type II	Worthington	LS994177
disscetion scissors	Kent Scientific	INS600124
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt	Sigma-Aldrich	G9002
Heating coil	Radnoti	158821
Heparin	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
induction chamber	CWE incorporated	13-40020
Isoflurane	Cp-pharma	1214
Jacketed heart chamber	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl x 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Nylon mesh (200 µm)	VWR-Germany	510-9527
pasteur pipette	Sigma Aldrich	Z331759
petri-dishes	Thermo Fisher	150318
Pluronic Acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
Roller Pump	Ismatec	ISM597D
surgical forceps	Kent Scientific	INS650908-4
surgical scissors	Kent Scientific	INS700540
suturing silk	Fine Science Tools	NC9416241
syringe	Merck	Z683531-100EA
Taurin	Sigma-Aldrich	86330