בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L
Summary
מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.
Abstract
מודלים של עכברים ממלאים תפקיד מכריע בחקר הפרעות קצב ומאפשרים לחקור מנגנונים מרכזיים של הפרעות קצב, כולל שינוי בתפקוד תעלת היונים וטיפול בסידן. לשם כך, קרדיומיוציטים פרוזדוריים או חדריים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק טלאי או לחקור הפרעות בטיפול בסידן. עם זאת, התשואה המוגבלת של קרדיומיוציטים באיכות גבוהה המתקבלים על ידי פרוטוקולי הבידוד הנוכחיים אינה מאפשרת את שתי המדידות באותו עכבר. מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, למדידות עוקבות בו זמנית של מעברי סידן וזרם סידן מסוג L מחיה אחת. לבבות עכבר מתקבלים, ואבי העורקים הוא cannulated במהירות כדי להסיר דם. לאחר מכן הלבבות מחוררים תחילה בתמיסה נטולת סידן (37°C) כדי לנתק את הרקמה ברמה של דיסקים משולבים ולאחר מכן בתמיסת אנזים המכילה מעט סידן כדי לשבש מטריצה חוץ-תאית (37°C). הלב המעוכל מנותח לאחר מכן לאטריה ולחדרים. דגימות רקמה נחתכות לחתיכות קטנות ומומסות על ידי פיפטציה בזהירות למעלה ולמטה. העיכול האנזימטי מופסק, והתאים מוכנסים מחדש בהדרגה לריכוזי הסידן הפיזיולוגיים. לאחר טעינה עם מחוון פלואורסצנטי Ca2+, קרדיומיוציטים מבודדים מוכנים למדידה בו זמנית של זרמי סידן וחולפים. בנוסף, נדונות מלכודות בידוד ופרוטוקולי מהדק טלאי ועקבות מייצגים של זרמי סידן מסוג L עם מדידות ארעיות סידן בו זמנית במיוציטים מורין פרוזדורים וחדריים שבודדו כמתואר לעיל.
Introduction
הפרעות קצב לב הן נפוצות ואחד האתגרים העיקריים כיום בתחום הבריאות, שכן הן משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. הפרעות קצב קשורות לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2 ומייצגות את הסיבה הבסיסית לרוב מקרי המוות הלבבי הפתאומי3. אפשרויות הטיפול העדכניות שיפרו את הישרדות המטופלים, אך עדיין מדובר בעיקר בטיפולים סימפטומטיים ולא במנגנונים הבסיסיים. לכן, טיפולים אלה הם בעלי יעילות מוגבלת ועלולים לגרום לעתים קרובות לתופעות לוואי חמורות 4,5,6. שיפור אפשרויות הטיפול הנוכחיות דורש תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית, מה שיוצר את הצורך במודלים מתאימים למחקר. מודלים של בעלי חיים קטנים – ובמיוחד מודלים של עכברים – ממלאים תפקיד מכריע במחקר הפרעות קצב, שכן הם מאפשרים לחקור מנגנוני מפתח של הפרעות קצב, למשל ההשפעה הגנטית על אלקטרופיזיולוגיה תאית, תפקוד תעלות יונים או טיפול בסידן 7,8.
לשם כך נדרשים קרדיומיוציטים פרוזדוריים וחדריים מבודדים בכמות מספקת וכדאיות. ספקטרום רחב של גישות בידוד שונות להשגת מיוציטים פרוזדוריים וחדריים תואר בעבר 9,10,11,12,13 וכמה קבוצות הציגו נתונים ממדידות סימולטניות של זרם מסוג L וזרם סידן המושרה על ידי מעבר סידן מפרוזדורים 14 או חדר 15 קרדיומיוציטים מורין. עם זאת, למיטב ידיעתנו אין נתונים זמינים על מדידות פרוזדורים כמו גם חדרים מחיה אחת. החוקרים מתמקדים במגוון רחב של נושאים, החל מאלקטרופיזיולוגיה ועד פרוטאומיקה, מחקרים פונקציונליים כמו התכווצות תאים או אינטראקציות חלבונים, תפקוד מיטוכונדריאלי או גנטיקה – כולם זקוקים לקרדיומיוציטים מבודדים. לפיכך, רבים מהפרוטוקולים שפורסמו לא פותחו במיוחד עבור מחקרי מהדק טלאי, מה שמוביל לתפוקות מוגבלות ואיכות תאים לא מספקת למחקרי מהדק טלאים. לפיכך, מדידות בו זמנית של מהדק טלאי וסידן ארעיות של תאים פרוזדוריים וחדרים שבודדו מבעל חיים אחד אינן יכולות להתבצע עם פרוטוקולים מבוססים.
בידוד של מיוציטים מורינים – במיוחד פרוזדורים – עבור ניסויים מהדק טלאי נותר מאתגר. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ומהירה לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באיכות גבוהה באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר לאחר מכן מדידות בו זמנית הן של זרם קרום נטו והן של מעבר סידן המושרה בזרם מחיה אחת. מאמר זה מפרט פרוטוקול לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים שמקורם בעכברים מסוג בר ובעכברים הנושאים מוטציות גנטיות. פרוטוקול זה יכול לשמש עכברים זכרים ונקבות כאחד. בידוד המיוציטים, התמונות והתוצאות המייצגות המתוארות להלן התקבלו מעכברי בר מסוג C57Bl/6 בגיל 6 (± 1) חודשים. עם זאת, פרוטוקול זה שימש בהצלחה עבור עכברים בגילאים שונים החל מ 2 עד 24 חודשים עם גנוטיפים שונים. איור 1 מראה את מערך הבידוד ותקריב של לב משומר במהלך זילוח אנזימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק דרך קלה ופונקציונלית להשיג מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה מאותו עכבר עבור מחקרי מהדק טלאי עם הקלטות סידן חולפות בו זמנית. איכות הנתונים המתקבלים תלויה מאוד באיכות בידוד התא. כפי שהוזכר לעיל, שיטות רבות לבודד קרדיומיוציטים murine תוארו בעבר 9,10,11,12.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG; תוכנית מדען קליני ברפואת כלי דם (PRIME), MA 2186/14-1 לפ’ טומסיץ וד’ שוטלר; VO1568/3-1, IRTG1816 ופרויקט SFB1002 A13 עד N. Voigt), קרן המחקר הגרמנית תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה (EXC 2067/1- 390729940 ל- N. Voigt), המרכז הגרמני למחקר קרדיווסקולרי (DZHK; 81X2600255 ל- S. Clauss ו- N. Voigt; 81Z0600206 ל- S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. Clauss), ERA-NET למחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל- S. Clauss), קרן היינריך-ולוטה-מילפנצל (ל-S. Clauss) וקרן Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 ל-N. Voigt). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
