Isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter för samtidiga mätningar av Ca2+ transienter och kalciumström av L-typ
Summary
Musmodeller gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes. För detta ändamål är högkvalitativa kardiomyocyter nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar. Här beskrivs en metod för att isolera murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som möjliggör samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ.
Abstract
Musmodeller spelar en avgörande roll i arytmiforskning och gör det möjligt att studera viktiga mekanismer för arytmogenes, inklusive förändrad jonkanalfunktion och kalciumhantering. För detta ändamål är förmaks- eller ventrikulära kardiomyocyter av hög kvalitet nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar eller för att utforska kalciumhanteringsavvikelser. Det begränsade utbytet av högkvalitativa kardiomyocyter erhållna med nuvarande isoleringsprotokoll tillåter emellertid inte båda mätningarna i samma mus. Denna artikel beskriver en metod för att isolera högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, för efterföljande samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ från ett djur. Mushjärtan erhålls, och aortan kanyleras snabbt för att avlägsna blod. Hjärtan perfuseras sedan initialt med en kalciumfri lösning (37 °C) för att dissociera vävnaden vid nivån av interkalerade skivor och därefter med en enzymlösning som innehåller lite kalcium för att störa extracellulär matris (37 °C). Det smälta hjärtat dissekeras därefter i atria och ventriklar. Vävnadsprover hackas i små bitar och löses upp genom att försiktigt pipettera upp och ner. Den enzymatiska nedbrytningen stoppas och cellerna återinförs stegvis till fysiologiska kalciumkoncentrationer. Efter belastning med en fluorescerande Ca2+-indikator prepareras isolerade kardiomyocyter för samtidig mätning av kalciumströmmar och transienter. Dessutom diskuteras isoleringsfallgropar och patch-clamp-protokoll och representativa spår av kalciumströmmar av L-typ med samtidiga kalciumövergående mätningar i förmaks- och ventrikulära murina myocyter isolerade enligt beskrivningen ovan tillhandahålls.
Introduction
Hjärtarytmier är vanliga och en av de nuvarande stora utmaningarna inom hälso- och sjukvården eftersom de påverkar miljontals människor världen över. Arytmier är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet 1,2 och utgör den bakomliggande orsaken till majoriteten av plötsliga hjärtdödsfall3. Uppdaterade behandlingsalternativ har förbättrat patienternas överlevnad men är fortfarande främst symptomatiska behandlingar snarare än inriktade på de underliggande mekanismerna. Således har dessa behandlingar begränsad effekt och kan ofta orsaka allvarliga biverkningar 4,5,6. En förbättring av nuvarande behandlingsalternativ kräver insikt i den underliggande patofysiologin, vilket skapar behov av lämpliga modeller att studera. Små djurmodeller – och specifikt musmodeller – spelar en avgörande roll i arytmiforskning eftersom de gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes, till exempel den genetiska påverkan på cellulär elektrofysiologi, jonkanalfunktion eller kalciumhantering 7,8.
För detta ändamål krävs isolerade förmaks- och ventrikulära kardiomyocyter med tillräcklig mängd och livskraft. Ett brett spektrum av olika isoleringsmetoder för att erhålla förmaks- och ventrikulära myocyter har tidigare beskrivits 9,10,11,12,13 och vissa grupper har presenterat data från samtidiga mätningar av ström av L-typ och kalciumströminducerade kalciumtransienter från antingen förmak 14 eller ventrikulär 15 murina kardiomyocyter. Men så vitt vi vet finns det inga data tillgängliga om förmaks- och ventrikulära mätningar från ett djur. Forskare fokuserar på ett brett spektrum av ämnen som sträcker sig från elektrofysiologi till proteomik, funktionella studier som cellkontraktilitet eller proteininteraktioner, mitokondriell funktion eller genetik – allt i behov av isolerade kardiomyocyter. Många av de publicerade protokollen har därför inte utvecklats specifikt för patch clamp-studier, vilket leder till begränsade utbyten och otillräcklig cellkvalitet för patch clamp-studier. Således kan samtidiga lappklämmor och kalciumtransienta mätningar av förmaks- och ventrikulära celler isolerade från ett djur inte utföras med etablerade protokoll.
Isolering av murina – särskilt förmaksmyocyter för patchklämma experiment är fortfarande utmanande. Denna artikel ger en enkel och snabb metod för isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som därefter möjliggör samtidiga mätningar av både nettomembranström och ströminducerade kalciumtransienter från ett djur. Denna artikel utarbetar ett protokoll för isolering av förmaks- och ventrikulära myocyter härrörande från vilda möss och möss som bär genetiska mutationer. Detta protokoll kan användas för både manliga och kvinnliga möss. Myocytisoleringen, bilderna och representativa resultat som beskrivs nedan erhölls från möss av vildtyp C57Bl/6 vid 6 (± 1) månaders ålder. Ändå har detta protokoll framgångsrikt använts för möss i olika åldrar från 2 till 24 månader med olika genotyper. Figur 1 visar isoleringsinställningen och en närbild av ett kanylerat hjärta under enzymperfusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel ger ett enkelt och funktionellt sätt att erhålla högkvalitativa förmaks- och ventrikulära myocyter från samma mus för patch-clamp-studier med samtidiga kalciumövergående inspelningar. Kvaliteten på de erhållna data beror i hög grad på kvaliteten på cellisoleringen. Som nämnts ovan har många metoder för att isolera murina kardiomyocyter beskrivits tidigare 9,10,11,12.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program i vaskulär medicin (PRIME), MA 2186/14-1 till P. Tomsits och D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 och SFB1002 projekt A13 till N. Voigt), tyska forskningsstiftelsen under Tysklands excellensstrategi (EXC 2067/1- 390729940 till N. Voigt), tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss och N. Voigt; 81Z0600206 till S. Kääb), Coronastiftelsen (S199/10079/2019 till S. Clauss), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss) och Else-Kröner-Fresenius Foundation (EKFS 2016_A20 till N. Voigt). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptberedningen.
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
