Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離
Summary
マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。
Abstract
マウスモデルは不整脈の研究において重要な役割を果たしており、イオンチャネル機能の変化やカルシウムの取り扱いなど、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することができます。この目的のために、パッチクランプ測定を行ったり、カルシウム取り扱い異常を探ったりするために、高品質の心房または心室心筋細胞が必要です。しかしながら、現在の単離プロトコルによって得られた高品質の心筋細胞の限られた収量は、同じマウスで両方の測定を可能にすることができない。この記事では、逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介して高品質のマウス心房および心室筋細胞を分離し、その後、1匹の動物からのカルシウム過渡現象とL型カルシウム電流を同時に測定する方法について説明します。マウスの心臓が得られ、大動脈を急速にカニューレに入れて血液を除去します。次に、心臓にカルシウムを含まない溶液(37°C)を灌流して、インターカレートされた椎間板のレベルで組織を解離させ、その後、カルシウムをほとんど含まない酵素溶液で細胞外マトリックスを破壊します(37°C)。消化された心臓はその後心房と心室に解剖されます。組織サンプルは細かく刻まれ、慎重に上下にピペッティングして溶解されます。酵素消化を停止し、細胞を生理学的カルシウム濃度まで段階的に再導入します。蛍光Ca2+指示薬をロードした後、単離された心筋細胞をカルシウム電流と過渡現象の同時測定用に調製します。さらに、分離の落とし穴が議論され、上記のように単離された心房および心室マウス筋細胞における同時カルシウム過渡測定を伴うパッチクランププロトコルおよびL型カルシウム電流の代表的な痕跡が提供されます。
Introduction
心不整脈は一般的であり、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるため、現在の主要な医療課題の1つです。不整脈は高い罹患率と死亡率1,2に関連しており、心臓突然死の大部分の根本的な原因を表しています3。最新の治療選択肢は患者の生存率を向上させましたが、根本的なメカニズムを標的とするのではなく、依然として主に対症療法です。したがって、これらの治療法の有効性は限られており、重篤な副作用を引き起こすことがよくあります4,5,6。現在の治療オプションを改善するには、根底にある病態生理学への洞察が必要であり、研究に適したモデルの必要性が生じます。小動物モデル、特にマウスモデルは、細胞の電気生理学、イオンチャネル機能、カルシウム処理に対する遺伝的影響など、不整脈形成の重要なメカニズムを研究できるため、不整脈研究において重要な役割を果たします7,8。
この目的のために、十分な量および生存率の単離された心房および心室心筋細胞が必要とされる。心房および心室筋細胞を得るための幅広い異なる単離アプローチが以前に説明されており9、10、11、12、13であり、一部のグループは、心房14または心室15のいずれかからのL型電流およびカルシウム電流誘発カルシウム過渡の同時測定からのデータを提示している。マウス心筋細胞。しかし、私たちの知る限り、1匹の動物からの心房および心室測定のデータはありません。研究者は、電気生理学からプロテオミクス、細胞収縮性やタンパク質相互作用などの機能研究、ミトコンドリア機能、遺伝学に至るまで、単離された心筋細胞を必要とする幅広いトピックに焦点を当てています。したがって、公開されているプロトコルの多くはパッチクランプ研究用に特別に開発されておらず、パッチクランプ研究には収量が制限され、細胞品質が不十分です。したがって、1匹の動物から単離された心房細胞と心室細胞のパッチクランプとカルシウム過渡の同時測定は、確立されたプロトコルでは実行できません。
パッチクランプ実験のためのマウス、特に心房筋細胞の単離は依然として困難です。本稿では、逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流法により、高品質のマウス心房および心室筋細胞を単離するための簡単で迅速な方法を提供し、その後、1匹の動物からの正味の膜電流と電流誘発カルシウム過渡現象の両方を同時に測定することができます。この記事では、野生型マウスおよび遺伝子変異を有するマウスに由来する心房および心室筋細胞を単離するためのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、オスとメスのマウスに同様に使用できます。筋細胞単離、画像、および以下に説明する代表的な結果は、6(±1)ヶ月齢の野生型C57Bl/6マウスから得られた。それにもかかわらず、このプロトコルは、異なる遺伝子型を有する2〜24ヶ月の範囲の様々な年齢のマウスに首尾よく使用されている。 図1 は、分離セットアップと酵素灌流中のカニューレ心臓のクローズアップを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、カルシウム一過性記録を同時に行うパッチクランプ研究のために、同じマウスから高品質の心房筋細胞と心室筋細胞を取得する簡単で機能的な方法を提供します。得られたデータの品質は、細胞単離の品質に大きく依存します。上述のように、マウス心筋細胞を単離する多くの方法が以前に記載されている9、10、11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツ研究財団(DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からP.トムシッツおよびD.シュットラーへ。VO1568/3-1、IRTG1816、およびSFB1002プロジェクトA13からN.フォークト)、ドイツの卓越性戦略の下でのドイツ研究財団(EXC 2067/1-390729940からN.フォークト)、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X2600255からS.クラウスおよびN.フォークト; 81Z0600206からS.ケーブ)、コロナ財団(S199/10079/2019からS.クラウス)、心血管疾患に関するERA-NET(ERA-CVD、01KL1910からS.クラウス)、 ハインリッヒ・アンド・ロッテ・ミュールフェンツル財団(S.クラウスへ)とエルゼ・クレーナー・フレゼニウス財団(EKFS 2016_A20 N.フォークトへ)。資金提供者は原稿の準備に何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. Cardiac safety assays. Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O’Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
