I fenotipi di crescita del lievito sono misurati con precisione attraverso l'imaging time-lapse altamente parallelo di cellule immobilizzate che crescono in microcolonie. Allo stesso tempo, la tolleranza allo stress, l'espressione proteica e la localizzazione delle proteine possono essere monitorate, generando set di dati integrati per studiare come le differenze ambientali e genetiche, così come l'eterogeneità gene-espressione tra le cellule isogeniche, modulano la crescita.
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Articolo metodologico
Imaging live ad alta produttività di microcolonie per misurare l'eterogeneità nella crescita e nell'espressione genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Misurazioni precise dell'eterogeneità tra e all'interno dello sforzo nei tassi di crescita microbica sono essenziali per comprendere gli input genetici e ambientali nella tolleranza allo stress, nella patogenicità e in altri componenti chiave dell'idoneità. Questo manoscritto descrive un saggio basato sul microscopio che tiene traccia di circa 105 microcoloni Saccharomyces cerevisiae per esperimento. Dopo l'imaging automatizzato time-lapse del lievito immobilizzato in una piastra multiwell, i tassi di crescita dei microcoloni vengono facilmente analizzati con un software di analisi delle immagini personalizzato. Per ogni microcolonia, è anche possibile monitorare l'espressione e la localizzazione di proteine fluorescenti e la sopravvivenza dello stress acuto. Questo saggio consente una stima precisa dei tassi di crescita medi dei ceppi, nonché una misurazione completa dell'eterogeneità nella crescita, nell'espressione genica e nella tolleranza allo stress all'interno delle popolazioni clonali.
Introduzione
I fenotipi di crescita contribuiscono in modo critico alla forma fisica del lievito. La selezione naturale può distinguere in modo efficiente tra lignaggi con tassi di crescita diversi dall'inverso della dimensione effettiva della popolazione, che può superare i 108 individui1. Inoltre, la variabilità dei tassi di crescita tra gli individui all'interno di una popolazione è un parametro evolutivamente rilevante, in quanto può servire come base per strategie di sopravvivenza come la copertura dellepuntate 2,3,4,5
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Protocollo
1. Preparazione di piastre randomizzate (prima del giorno dell'esperimento)
- Pianificare i ceppi e le condizioni da testare con il test di crescita. A questo punto, assegnare casualmente ceppi e condizioni a qualsiasi pozzo.
NOTA: Quando si considera la configurazione della piastra, è consigliabile includere più di una replica per sforzo e condizione di crescita su una singola piastra per tenere conto del rumore ben correlato nelle misurazioni. Per ulteriori dettagli, vedere Discussione. - Randomizzare computazalmente la posizione di ogni deformazione e condizione ambientale per le repliche delle piastre che verranno eseguite in giorni diversi.
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Risultati
La novità di questo protocollo è che il tasso di crescita può essere calcolato per le singole cellule all'interno di una popolazione monitorando la loro crescita in microcolonie attraverso l'imaging time-lapse (Figura 2A). Poiché le microcolonie crescono per molte ore in modo planare a causa della presenza di concanavalina A, le loro aree possono essere tracciate durante l'esperimento e una vestibilità lineare al cambiamento nel log naturale dell'area nel tempo può essere utilizzata per calc.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è un saggio versatile che consente di monitorare simultaneamente la crescita cellulare e l'espressione genica a livello delle singole microcolonie. La combinazione di queste due modalità produce intuizioni biologiche uniche. Ad esempio, lavori precedenti hanno usato questo saggio per mostrare una correlazione negativa tra l'espressione del gene TSL1 e il tasso di crescita della microcolonia nelle cellule di tipo selvatico isogenico misurandoentrambi contemporaneament.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Naomi Ziv, Sasha Levy e Shuang Li per i loro contributi allo sviluppo di questo protocollo, David Gresham per le attrezzature condivise e Marissa Knoll per l'aiuto nella produzione video. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dei National Institutes of Health R35GM118170.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| 500 mL Filtro per flaconi .22 & micro; m PES sterilizzante, basso legame proteico, con collo da 45 mm | Fisher CLS431154 | utilizzato per filtrare i terreni | |
| BD Falcon*Piastre per colture tissutali, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | Provette per coltura a 96 pozzetti utilizzate per congelare le cellule, pre-crescere le cellule e diluire |
| Siringhe BD senza ago, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Utilizzato per filtrare la Concanavalin A |
| Costar Serbatoi sterili di reagenti monouso | Serbatoi | 07-200-127 | utilizzati per pipettare soluzioni con pipetta multicanale |
| Nastro sigillante in alluminio Costar Thermowell | 07-200-684 | Sigillatura per piastre a 96 pozzetti per lanugine pre-crescita e | |
| congelamento e salviette Kimwipes Fisher | 06-666A | prive di lanugine e elettricità statica per mantenere il fondo della piastra del microscopio libero da detriti e graffi | |
| Filtri | per siringhe NalgeneThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0,2 μ m dimensione dei pori, diametro 25 mm; utilizzato per filtrare la soluzione di concanavalina A |
| Media Componenti | |||
| Terreni minimi chimicamente definiti (MD; 2% glucosio) | Terreni di microscopia alternativi utilizzati per la pre-crescita del lievito e la crescita durante la microscopia | ||
| Terreni di microscopia sintetici completi (SC; 2% glucosio) | terreni di microscopia utilizzati per la pre-crescita e la crescita del lievito durante la microscopia | ||
| Estratto di lievito-peptone-destrosio (YEPD; 2% glucosio) crescita cellulare media | prima del congelamento di piastre randomizzate | ||
| Microscopia Materiali | |||
| Breathe-Easy membrana sigillante | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | utilizzate per sigillare la piastra durante l'esperimento di microscopia. In questa fase si consigliano membrane traspiranti perché impediscono la condensa nei pozzetti e consentono di ottenere migliori immagini al microscopio |
| Piastra per microscopio con fondo piatto in vetro trasparente a 96 pozzetti | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | piastra per microscopio |
| Concanavalin A da canavalia ensiformis (Jack Bean), polvere liofilizzata | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Preparare 5 soluzioni di concanavalina A e congelare 5 ml di 5 volte concanavalina A in provette coniche da 50 mL a -80 gradi; Ceppi C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Ceppi di accumulo di mutazioni aploidi in un background di laboratorio, descritti in Hall e Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progenie del ceppo ancestrale di accumulo di mutazioni di Hall e Joseph 2010, trasformati con YFR054cΔ::Scw11P: :GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 con attacco | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E con Perfect Focus System | Microscopio invertito con tavolino automatizzato e sistema di messa a fuoco automatica |
Riferimenti
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
- Kussell, E., Leibler, S.
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Ristampe e permessi
