מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה
Summary
פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.
Abstract
האינטראקציות המוקדמות בין שכבת האפיתל באף לבין תאי החיסון המולדים במהלך זיהומים ויראליים נותרות אזור שלא נחקר. המשמעות של איתות חסינות מולדת בזיהומים ויראליים גדלה באופן משמעותי כמו חולים עם זיהומים בדרכי הנשימה המציגים הפעלה גבוהה של תאי T מולד להראות תוצאה טובה יותר של המחלה. לפיכך, ניתוח אינטראקציות חיסוניות מולדות מוקדמות אלה מאפשר הבהרה של התהליכים השולטים בהם ועשוי להקל על פיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות ואסטרטגיות לשיכוך או אפילו למניעת התקדמות מוקדמת של זיהומים ויראליים. פרוטוקול זה מפרט מודל רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שיחות צולבות מוקדמות, אינטראקציות והפעלה של תאי חיסון מולדים מגורמים המופרשים על ידי תאי אפיתל נגועים בדרכי הנשימה. באמצעות נגיף שפעת H3N2 (A/Aichi/2/1968) כמודל הנגיף המייצג, הפעלה מולדת של תאים מונו-גרעיניים של דם היקפי בתרבית משותפת (PBMCs) נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לחקור את תת-קבוצות התאים המופעלים על ידי הגורמים המסיסים המשתחררים מהאפיתל בתגובה לזיהום הנגיפי. התוצאות ממחישות את אסטרטגיית ההצטיידות להבחנה בין תת-קבוצות התאים וחושפות את ההבדלים הברורים בין האוכלוסיות הפעילות של PBMCs לבין השיחה הצולבת שלהם עם האפיתל הנגוע והבקרה. לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את קבוצות המשנה המופעלות כדי לקבוע את תפקודן, כמו גם שינויים מולקולריים ספציפיים לתאים. ממצאים מחקירה צולבת כזו עשויים לחשוף גורמים החשובים להפעלת אוכלוסיות תאים מולדות חיוניות, המועילות לשליטה ודיכוי התקדמות הזיהום הנגיפי. יתר על כן, גורמים אלה יכולים להיות מיושמים באופן אוניברסלי על מחלות ויראליות שונות, במיוחד על וירוסים חדשים המתעוררים, כדי לדכא את ההשפעה של וירוסים כאלה כאשר הם מסתובבים לראשונה באוכלוסיות אנושיות תמימות.
Introduction
וירוסים נשימתיים הם אולי בין הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים לנטל בריאותי וכלכלי חמור. מההתפרצויות הגלובליות התקופתיות של זני מגיפה מתפתחים (למשל, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ועד לזנים העונתיים של שפעת מדי שנה, וירוסים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור. למרות שחיסונים מהווים את עיקר התגובה לאתגרים גלובליים אלה של בריאות הציבור, זה מפוכח לציין כי אמצעי נגד אלה הם רק מגיבים 1,2. יתר על כן, עיכוב בין הופעתו של זן זיהומי חדש לבין הפיתוח המוצלח של החיסון שלו הוא בלתי נמנע3, מה שמוביל לתקופה שבה האמצעים הזמינים לריסון התפשטות הנגיף מוגבלים מאוד.
עיכובים אלה מודגשים עוד יותר על ידי העלויות הנגרמות על החברה-כלכלית והחברתית. השפעת העונתית לבדה אחראית לכ-8 מיליארד דולר בעלויות עקיפות, 3.2 מיליארד דולר בהוצאות רפואיות ו-36.3 אלף מקרי מוות בארצות הברית מדי שנה4. זאת לפני התחשבות בעלויות המחקר הדרושות למימון פיתוח חיסון. התפרצויות מגיפה יש השפעות חמורות עוד יותר על החברה, יחד עם הקצב הגובר של הגלובליזציה מדי שנה, כפי שמעידים השיבושים הגלובליים הנגרמים על ידי הופעתה והתפשטות מהירה של תסמונת נשימה חריפה חמורה coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
מחקרים אחרונים הראו כי חולים נגועים שיש להם אוכלוסייה גדולה יותר של תאי T מולדים מופעלים נוטים להיות תוצאה טובה יותרשל המחלה 8,9,10. יתר על כן, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת מסווגת לתת-קבוצות מרובות: תאי T (MAIT) הקשורים לריבית, תאי Vδ1 γδ T, תאי Vδ2 γδ T ותאי T הרוצח הטבעי (NKT). תת-קבוצות אלה של תאי T מולדים מציגות גם הטרוגניות בתוך האוכלוסיות שלהם, מה שמגביר את המורכבות של האינטראקציות בין אוכלוסיות התאים המעורבות בתגובה החיסונית המולדת11. לפיכך, המנגנון המפעיל תאי T מולדים אלה והידע של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T מולדים עשוי לספק שדרה אחרת של מחקר כדי לצמצם את ההשפעות הזיהומיות של וירוסים אלה על הפונדקאי האנושי, במיוחד בתקופה של פיתוח החיסון.
תאי אפיתל נגועים בשפעת לייצר גורמים המפעילים תאי T מולדים במהירות 12,13,14. בהתבסס על ממצא זה, מודל תרבות משותף זה של ממשק אוויר-נוזלי (ALI) ללא מגע שואף לחקות את האינטראקציות הכימיות המוקדמות (בתיווך גורמים מסיסים שפורסמו על ידי שכבת האפיתל הנגועה) בין שכבת אפיתל האף הנגועה לבין ה- PBMCs במהלך ההדבקה המוקדמת. ההפרדה הפיזית בין שכבת האפיתל באף (בתרבית על תוספות ממברנה) לבין ה- PBMCs (בתא שמתחת) ושלמות האפיתל מונעים זיהום ישיר של ה- PBMCs על ידי הנגיף, ומאפשרים מחקר מפורט של ההשפעות של גורמי מסיסים שמקורם באפיתל על ה- PBMCs. לכן ניתן לחקור עוד יותר את הגורמים המזוהים על הפוטנציאל הטיפולי שלהם בגרימת אוכלוסיית תאי ה- T המולדת המתאימה שעשויה להגן מפני זיהום שפעת. מאמר זה פירט אפוא את השיטות של הקמת תרבות משותפת לחקר הפעלה מולדת של תאי T מגורמים מסיסים שמקורם באפיתל.
Protocol
Representative Results
Discussion
תגובות חיסוניות מולדות נגד וירוסים הן תחום מחקר שלא נחקר בניהול אנטי-ויראלי. תאי האפיתל בדרכי הנשימה ותאי החיסון המולדים פועלים בתיאום כדי לדכא שכפול ויראלי במהלך זיהום, מלבד לשמש כגורם דטרמיננטה של תגובה אדפטיבית מוגזמת אם העומס הנגיפי אינו נשמר בבדיקה 12,13,17.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לצוות המחקר במחלקה לאוטולרנגולוגיה של NUS ולמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה על עזרתם בעבודה הקשורה לתרבות HNEC ולתרבות ויראלית. ברצוננו גם להודות למנתחים ולצוות הכירורגי בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי, המחלקה לאוטולרנגולוגיה, על עזרתם באספקת דגימות התא והדם הנדרשות למחקר.
מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור לא. NMRC/CIRG/1458/2016 (לדה יון וואנג) ו-MOH-OFYIRG19may-0007 (לקאי סן טאן). קאי סן טאן הוא מקבל תמיכה מלגה ממלגת מחקר לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (EAACI) אירופאית לשנת 2019.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
