呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル
Summary
このプロトコルは、ウイルス感染した鼻上皮細胞と先天性細胞活性化との間の初期の相互作用の調査を詳述する。免疫細胞の個々のサブセットは、ウイルス感染に応答したそれらの活性化に基づいて区別することができる。その後、それらをさらに調査して、早期の抗ウイルス反応に対するそれらの効果を決定することができる。
Abstract
ウイルス感染中の鼻上皮層と自然免疫細胞との間の初期の相互作用は、依然として未調査の領域である。ウイルス感染における自然免疫シグナル伝達の重要性は、高い先天性T細胞活性化を示す呼吸器感染症の患者がより良い疾患転帰を示すにつれて大幅に増加している。したがって、これらの初期の自然免疫相互作用を解剖することは、それらを支配するプロセスの解明を可能にし、ウイルス感染の早期進行を抑制または予防するための潜在的な治療標的および戦略の開発を促進する可能性がある。このプロトコルは、ウイルス感染気道上皮細胞によって分泌される因子からの自然免疫細胞の早期クロストーク、相互作用、および活性化を研究するために使用できる汎用性の高いモデルを詳述しています。H3N2インフルエンザウイルス(A/Aichi/2/1968)を代表的なウイルスモデルとして用い、共培養末梢血単核球(PBMC)の先天性細胞活性化をフローサイトメトリーを用いて解析し、ウイルス感染に応答して上皮から放出される可溶性因子によって活性化される細胞のサブセットを調べた。この結果は、細胞のサブセットを分化させるためのゲーティング戦略を実証し、PBMCの活性化集団と、対照および感染した上皮とのクロストークとの間の明確な違いを明らかにした。活性化されたサブセットをさらに分析して、それらの機能および細胞に特異的な分子変化を決定することができる。このようなクロストーク調査からの知見は、ウイルス感染の進行を制御および抑制するのに有益である重要な先天性細胞集団の活性化に重要な因子を明らかにする可能性がある。さらに、これらの要因は、異なるウイルス疾患、特に新たに出現したウイルスに普遍的に適用され、そのようなウイルスが素朴なヒト集団で最初に循環するときの影響を和らげることができる。
Introduction
呼吸器ウイルスは、おそらく深刻な医療と経済的負担を引き起こす最も広範な病原体の1つです。新興流行株(H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19など)の定期的な世界的な流行から、毎年のインフルエンザの季節性株まで、ウイルスは公衆衛生にとって絶え間ない脅威です。ワクチンは、これらの世界的な公衆衛生上の課題に対する対応の主な部分を占めていますが、これらの対策が単に応答性が高いことに注意するのは冷静です1,2。さらに、新しい感染株の出現とそのワクチンの開発の成功との間の遅れは避けられず3、ウイルスの拡散を抑制するために利用可能な措置が非常に限られている期間につながる。
これらの遅れは、社会経済的および社会的に負わされるコストによってさらに強調されています。季節性インフルエンザだけでも、米国では年間約80億ドルの間接費、32億ドルの医療費、363万人の死亡の原因となっています4。これは、ワクチン開発に資金を提供するために必要な研究費を考慮する前のことです。重症急性呼吸器症候群コロノウイルス2(SARS-CoV-2)5,6,7の出現と急速な拡大によって引き起こされる世界的な混乱によって証明されるように、流行の流行は社会にさらに深刻な影響を及ぼし、毎年のグローバリゼーションの速度の増加によって悪化しています。
最近の研究では、活性化された先天性T細胞の集団が多い感染患者は、より良い疾患転帰を有する傾向があることが示されている8,9,10。さらに、先天的T細胞集団は、粘膜関連不変T(MAIT)細胞、Vδ1γδT細胞、Vδ2γδT細胞、およびナチュラルキラーT(NKT)細胞の複数のサブグループに分類される。先天性T細胞のこれらのサブグループはまた、それらの集団内で不均一性を示し、自然免疫応答に関与する細胞集団間の相互作用の複雑さを増大させる11。したがって、これらの先天的T細胞を活性化するメカニズムおよび先天的T細胞の特定のサブグループの知識は、特にワクチン開発の期間中に、ヒト宿主に対するこれらのウイルスの感染効果を抑制するための異なる研究手段を提供する可能性がある。
インフルエンザに感染した上皮細胞は、先天性のT細胞を急速に活性化する因子を産生する12、13、14。この知見に基づいて、この非接触気液界面(ALI)共培養モデルは、感染初期の鼻上皮層とPBMCとの間の初期の化学的相互作用(感染上皮層によって放出される可溶性因子によって媒介される)を模倣することを目的としている。鼻上皮層(膜挿入物上で培養)とPBMC(下のチャンバー内)との間の物理的分離および上皮の完全性は、ウイルスによるPBMCの直接感染を防ぎ、PBMCに対する上皮由来可溶性因子の影響の詳細な研究を可能にする。したがって、同定された因子は、インフルエンザ感染から保護し得る適切な先天性T細胞集団を誘導する際のそれらの治療可能性についてさらに調査することができる。したがって、この論文は、上皮由来可溶性因子からの先天的T細胞活性化の研究のための共培養を確立する方法を詳述した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルスに対する自然免疫応答は、抗ウイルス管理における研究の過小評価されている分野です。気道上皮細胞と自然免疫細胞は、ウイルス量がチェックにとどまらない場合、過活動適応応答の決定因子として機能するだけでなく、感染中のウイルス複製を抑制するために協調して働く12,13,17。しかしながら、適切な抗ウ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NUS耳鼻咽喉科と微生物学・免疫学部門の研究スタッフの皆様には、hNECの培養・ウイルス培養関連業務にご協力いただき、誠にありがとうございます。また、国立大学病院耳鼻咽喉科の外科医と外科チームには、研究に必要な細胞および血液サンプルの提供に協力していただき、感謝申し上げます。
この研究は、シンガポール国立医学研究評議会によって資金提供されました。NMRC/CIRG/1458/2016 (De Yun Wang宛) および MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan宛).カイ・セン・タンは、欧州アレルギー・臨床免疫学(EAACI)リサーチフェローシップ2019からフェローシップ支援を受けています。
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
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