Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório
Summary
Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.
Abstract
As interações precoces entre a camada epitelial nasal e as células imunes inatas durante infecções virais permanecem uma área pouco explorada. A significância da sinalização de imunidade inata em infecções virais aumentou substancialmente à medida que pacientes com infecções respiratórias que apresentam alta ativação de células T inatas mostram um melhor desfecho da doença. Assim, dissecar essas interações imunológicas inatas precoces permite a elucidação dos processos que os regem e pode facilitar o desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos e estratégias para amortecer ou mesmo prevenir a progressão precoce de infecções virais. Este protocolo detalha um modelo versátil que pode ser usado para estudar o crosstalk precoce, interações e ativação de células imunes inatas a partir de fatores secretados por células epiteliais viralmente infectadas pelas vias aéreas. Utilizando um vírus de influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo representativo do vírus, a ativação celular inata de células mononucleares periféricas co-cultivadas (PBMCs) foi analisada usando citometria de fluxo para investigar os subconjuntos das células que são ativadas pelos fatores solúveis liberados do epitélio em resposta à infecção viral. Os resultados demonstram a estratégia de diferenciação dos subconjuntos das células e revelam as diferenças claras entre as populações ativadas de PBMCs e seu crosstalk com o controle e epitélio infectado. Os subconjuntos ativados podem então ser analisados para determinar suas funções, bem como alterações moleculares específicas das células. Os achados de tal investigação de crosstalk podem descobrir fatores importantes para a ativação de populações celulares inatas vitais, que são benéficas no controle e na supressão da progressão da infecção viral. Além disso, esses fatores podem ser universalmente aplicados a diferentes doenças virais, especialmente em vírus recém-emergentes, para amortecer o impacto desses vírus quando circulam pela primeira vez em populações humanas ingênuas.
Introduction
Os vírus respiratórios estão talvez entre os patógenos mais difundidos que causam cuidados de saúde graves e carga econômica. Desde os surtos globais periódicos de cepas epidêmicas emergentes (por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) até as cepas sazonais da gripe todos os anos, os vírus são uma ameaça constante à saúde pública. Embora as vacinas formem a maior parte da resposta a esses desafios globais de saúde pública, é preocupante notar que essas contramedidas sãomeramente responsivas 1,2. Além disso, um atraso entre o surgimento de uma nova cepa infecciosa e o desenvolvimento bem-sucedido de sua vacina é inevitável3, levando a um período em que as medidas disponíveis para conter a propagação do vírus são altamente limitadas.
Esses atrasos são ainda mais enfatizados pelos custos que são infligidos à sociedade economicamente e socialmente. Só a gripe sazonal é responsável por aproximadamente US$ 8 bilhões em custos indiretos, US$ 3,2 bilhões em custos médicos e 36,3 mil mortes nos Estados Unidos da América anualmente4. Isso é antes da consideração dos custos de pesquisa necessários para financiar o desenvolvimento de vacinas. Surtos epidêmicos têm efeitos ainda mais graves na sociedade, agravados pelo aumento da taxa de globalização a cada ano, como evidenciado pelas perturbações globais causadas pelo surgimento e rápida disseminação da síndrome respiratória aguda grave coronovírus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Estudos recentes têm mostrado que pacientes infectados com maior população de células T inatas ativadas tendem a ter um melhor desfecho da doença 8,9,10. Além disso, a população de células T inatas é categorizada em múltiplos subgrupos: as células invariantes associadas à mucosa T (MAIT), células Vδ1 γδ T, células Vδ2 γδ T e as células T (NKT) assassinas naturais. Esses subgrupos de células T inatas também apresentam heterogeneidade dentro de suas populações, aumentando a complexidade das interações entre as populações celulares envolvidas na resposta imune inata11. Assim, o mecanismo que ativa essas células T inatas e o conhecimento dos subgrupos específicos de células T inatas podem fornecer uma via diferente de pesquisa para reduzir os efeitos infecciosos desses vírus no hospedeiro humano, especialmente durante o período de desenvolvimento vacinal.
As células epiteliais infectadas pela gripe produzem fatores que ativam rapidamenteas células T inatas 12,13,14. Com base nessa descoberta, este modelo de co-cultura de Interface Ar-Líquido (ALI) sem contato tem como objetivo imitar as interações químicas iniciais (mediadas por fatores solúveis liberados pela camada epitelial infectada) entre a camada epitelial nasal infectada e os PBMCs durante a infecção precoce. A separação física entre a camada epitelial nasal (cultivada nas pastilhas de membrana) e os PBMCs (na câmara inferior) e a integridade epitelial previne a infecção direta dos PBMCs pelo vírus, permitindo um estudo detalhado dos efeitos dos fatores solúveis derivados da epitelial nos PBMCs. Os fatores identificados podem, portanto, ser investigados por seu potencial terapêutico em induzir a população de células T inatas apropriadas que possam proteger contra a infecção por gripe. Este artigo, portanto, detalhou os métodos de estabelecer uma cocultura para o estudo da ativação inata de células T a partir de fatores solúveis derivados do epitélio.
Protocol
Representative Results
Discussion
As respostas imunológicas inatas contra vírus são um campo de estudo pouco investigado no manejo antiviral. As células epiteliais das vias aéreas e as células imunes inatas trabalham em conjunto para suprimir a replicação viral durante uma infecção, além de servir como determinante de resposta adaptativa hiperativa se a carga viral não for mantida em xeque 12,13,17. No entanto, o desenvolvimento de um modelo humano r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à equipe de pesquisa do Departamento de Otorquinologia e Departamento de Microbiologia e Imunologia da NUS por sua ajuda com o trabalho relacionado à cultura e à cultura viral do HNEC. Gostaríamos também de agradecer aos cirurgiões e equipe cirúrgica do Hospital Universitário Nacional, Departamento de Otormologia, por sua ajuda no fornecimento das amostras de células e sangue necessárias para o estudo.
Este estudo foi financiado pelo National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (para De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (para Kai Sen Tan). Kai Sen Tan é um beneficiário do apoio de bolsas da European Allergy and Clinical Imunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
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