Denne protokollen beskriver en undersøkelse av de tidlige interaksjonene mellom viralt infiserte neseepitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper av immunceller kan skille seg ut basert på deres aktivering som svar på virusinfeksjoner. De kan deretter undersøkes nærmere for å fastslå deres effekter på tidlige antivirale responser.
De tidlige interaksjonene mellom neseepitelandslaget og de medfødte immuncellene under virusinfeksjoner forblir et underutforsuppet område. Betydningen av medfødt immunitetssignalering ved virusinfeksjoner har økt betydelig ettersom pasienter med luftveisinfeksjoner som viser høy medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sykdomsutfall. Derfor tillater dissekering av disse tidlige medfødte immuninteraksjonene belysningen av prosessene som styrer dem og kan lette utviklingen av potensielle terapeutiske mål og strategier for demping eller til og med forhindre tidlig progresjon av virusinfeksjoner. Denne protokollen beskriver en allsidig modell som kan brukes til å studere tidlig krysstale, interaksjoner og aktivering av medfødte immunceller fra faktorer utskilt av viralt infiserte luftveisepitelceller. Ved hjelp av et H3N2 influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell, har medfødt celleaktivering av samkulturerte perifere mononukleære celler i perifert blod (PBMCer) blitt analysert ved hjelp av strømningscytometri for å undersøke undergruppene av celler som aktiveres av de løselige faktorene som frigjøres fra epitelet som svar på virusinfeksjonen. Resultatene viser gating strategien for å differensiere undergrupper av celler og avsløre de klare forskjellene mellom de aktiverte populasjonene av PBMCs og deres krysstale med kontroll og infisert epitel. De aktiverte delsettene kan deretter analyseres ytterligere for å bestemme deres funksjoner samt molekylære endringer som er spesifikke for cellene. Funn fra en slik krysstaleundersøkelse kan avdekke faktorer som er viktige for aktivering av vitale medfødte cellepopulasjoner, som er gunstige for å kontrollere og undertrykke utviklingen av virusinfeksjon. Videre kan disse faktorene brukes universelt på forskjellige virussykdommer, spesielt for nylig fremvoksende virus, for å dempe virkningen av slike virus når de først sirkulerer i naive menneskelige populasjoner.
Respiratoriske virus er kanskje blant de mest utbredte patogenene som forårsaker alvorlig helsehjelp og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale utbruddene av fremvoksende epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sesongmessige belastningene av influensa hvert år, er virus en konstant trussel mot folkehelsen. Selv om vaksiner utgjør hoveddelen av responsen på disse globale folkehelseutfordringene, er det nøkternt å merke seg at disse mottiltakene bare er responsive 1,2. Videre er en forsinkelse mellom fremveksten av en ny smittsom stamme og den vellykkede utviklingen av vaksinen uunngåelig3, noe som fører til en periode da tiltak tilgjengelig for å dempe spredningen av viruset er svært begrenset.
Disse forsinkelsene understrekes videre av kostnadene som påføres samfunnet økonomisk og sosialt. Sesonginfluensaen alene er ansvarlig for omtrent 8 milliarder dollar i indirekte kostnader, 3,2 milliarder dollar i medisinske kostnader og 36,3 tusen dødsfall i USA årlig4. Dette er før vurdering av forskningskostnadene som er nødvendige for å finansiere vaksineutvikling. Epidemiske utbrudd har enda mer alvorlige effekter på samfunnet, forsterket av den økende globaliseringsraten hvert år, noe som fremgår av de globale forstyrrelsene forårsaket av fremveksten og rask spredning av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Nyere studier har vist at infiserte pasienter som har en større populasjon av aktiverte medfødte T-celler har en tendens til å ha et bedre sykdomsutfall 8,9,10. Videre er den medfødte T-cellepopulasjonen kategorisert i flere undergrupper: de mucosal-assosierte invariante T (MAIT) cellene, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige killer T (NKT) cellene. Disse undergruppene av medfødte T-celler viser også heterogenitet i populasjonene, noe som øker kompleksiteten i interaksjonene mellom cellepopulasjonene som er involvert i den medfødte immunresponsen11. Derfor kan mekanismen som aktiverer disse medfødte T-cellene og kunnskapen om de spesifikke undergruppene av medfødte T-celler gi en annen måte å forske på for å begrense de smittsomme effektene av disse virusene på den menneskelige verten, spesielt i løpet av vaksineutviklingsperioden.
Epitelceller infisert av influensa produserer faktorer som aktiverer medfødte T-celler raskt 12,13,14. Basert på dette funnet, har denne kontaktfrie Air-Liquid Interface (ALI) samkulturmodellen som mål å etterligne de tidlige kjemiske interaksjonene (mediert av løselige faktorer utgitt av det infiserte epitellaget) mellom det infiserte neseepitellaget og PBMC-ene under tidlig infeksjon. Den fysiske separasjonen mellom neseepitelelaget (dyrket på membraninnlegg) og PBMC-ene (i kammeret under) og epitelintegriteten forhindrer direkte infeksjon av PBMC-ene av viruset, noe som gir en detaljert studie av effekten av epitelavledede løselige faktorer på PBMC-ene. De identifiserte faktorene kan derfor undersøkes nærmere for deres terapeutiske potensial i å indusere den aktuelle medfødte T-cellepopulasjonen som kan beskytte mot influensainfeksjon. Dette dokumentet har derfor detaljert metodene for å etablere en medkultur for studiet av medfødt T-celleaktivering fra epitel-avledede løselige faktorer.
Medfødte immunresponser mot virus er et under-undersøkt studiefelt i antiviral behandling. Luftveis epitelceller og medfødte immunceller fungerer sammen for å undertrykke viral replikasjon under en infeksjon, i tillegg til å fungere som en determinant for overaktiv adaptiv respons hvis virusbelastningen ikke holdes i sjakk 12,13,17. Utviklingen av en relevant menneskelig modell for studiet av epitel-medfødt immunkorstale f…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke vitenskapelig ansatte ved NUS Institutt for otolaryngologi og Institutt for mikrobiologi og immunologi for deres hjelp med hNEC kultur- og viralkulturrelatert arbeid. Vi vil også takke kirurgene og operasjonsteamet ved Nasjonalt universitetssykehus, Institutt for otolaryngologi, for deres hjelp til å gi cellen og blodprøvene som kreves for studien.
Denne studien ble finansiert av National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er mottaker av stipendiatstøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
12-well Plate | Corning | 3513 | |
12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
24-well Plate | Corning | 3524 | |
24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
Crystal Violet | Merck | C6158 | |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
hNESPCs | Human Donors | NA | |
Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
T25 Flask | Corning | 430639 | |
T75 Flask | Corning | 430641U | |
TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |