Detta protokoll beskriver en undersökning av de tidiga interaktionerna mellan viralt infekterade nasala epitelceller och medfödd cellaktivering. Individuella delmängder av immunceller kan särskiljas baserat på deras aktivering som svar på virusinfektioner. De kan sedan undersökas ytterligare för att bestämma deras effekter på tidiga antivirala svar.
De tidiga interaktionerna mellan det nasala epitelskiktet och de medfödda immuncellerna under virusinfektioner är fortfarande ett underutforskat område. Betydelsen av medfödd immunitetssignalering vid virusinfektioner har ökat avsevärt eftersom patienter med luftvägsinfektioner som uppvisar hög medfödd T-cellaktivering visar ett bättre sjukdomsutfall. Därför möjliggör dissekering av dessa tidiga medfödda immuninteraktioner att belysa de processer som styr dem och kan underlätta utvecklingen av potentiella terapeutiska mål och strategier för att dämpa eller till och med förhindra tidig progression av virusinfektioner. Detta protokoll beskriver en mångsidig modell som kan användas för att studera tidig överhörning, interaktioner och aktivering av medfödda immunceller från faktorer som utsöndras av viralt infekterade luftvägsepitelceller. Med hjälp av ett H3N2-influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell har medfödd cellaktivering av samkullade mononukleära blodceller (PBMC) analyserats med hjälp av flödescytometri för att undersöka delmängderna av celler som aktiveras av de lösliga faktorer som frigörs från epitelet som svar på virusinfektionen. Resultaten visar gatingstrategin för att differentiera delmängderna av celler och avslöjar de tydliga skillnaderna mellan de aktiverade populationerna av PBMC och deras överhörning med kontroll- och infekterat epitel. De aktiverade delmängderna kan sedan analyseras ytterligare för att bestämma deras funktioner såväl som molekylära förändringar som är specifika för cellerna. Resultat från en sådan överhörningsundersökning kan avslöja faktorer som är viktiga för aktiveringen av vitala medfödda cellpopulationer, som är fördelaktiga för att kontrollera och undertrycka utvecklingen av virusinfektion. Dessutom kan dessa faktorer universellt tillämpas på olika virussjukdomar, särskilt på nya virus, för att dämpa effekterna av sådana virus när de först cirkulerar i naiva mänskliga populationer.
Luftvägsvirus är kanske bland de mest utbredda patogenerna som orsakar allvarlig hälso- och sjukvård och ekonomisk börda. Från de periodiska globala utbrotten av nya epidemiska stammar (t.ex. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) till säsongsstammarna av influensa varje år är virus ett ständigt hot mot folkhälsan. Även om vacciner utgör huvuddelen av svaret på dessa globala folkhälsoutmaningar, är det nyktert att notera att dessa motåtgärder bara svarar 1,2. Dessutom är en fördröjning mellan uppkomsten av en ny smittsam stam och den framgångsrika utvecklingen av dess vaccin oundviklig3, vilket leder till en period då tillgängliga åtgärder för att begränsa spridningen av viruset är mycket begränsade.
Dessa förseningar understryks ytterligare av de kostnader som åsamkas samhället ekonomiskt och socialt. Säsongsinfluensan ensam är ansvarig för cirka 8 miljarder dollar i indirekta kostnader, 3,2 miljarder dollar i medicinska kostnader och 36,3 tusen dödsfall i USA årligen4. Detta är före övervägande av de forskningskostnader som är nödvändiga för att finansiera vaccinutveckling. Epidemiska utbrott har ännu allvarligare effekter på samhället, förvärras av den ökande globaliseringstakten varje år, vilket framgår av de globala störningar som orsakas av uppkomsten och den snabba spridningen av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7.
Nya studier har visat att infekterade patienter med en större population av aktiverade medfödda T-celler tenderar att ha ett bättre sjukdomsutfall 8,9,10. Vidare kategoriseras den medfödda T-cellpopulationen i flera undergrupper: de slemhinneassocierade invarianta T-cellerna (MAIT), Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler och de naturliga mördar-T-cellerna (NKT). Dessa undergrupper av medfödda T-celler uppvisar också heterogenitet inom sina populationer, vilket ökar komplexiteten i interaktionerna mellan cellpopulationerna som är involverade i det medfödda immunsvaret11. Därför kan mekanismen som aktiverar dessa medfödda T-celler och kunskapen om de specifika undergrupperna av medfödda T-celler ge en annan forskningsväg för att begränsa de infektiösa effekterna av dessa virus på den mänskliga värden, särskilt under perioden med vaccinutveckling.
Epitelceller infekterade av influensa producerar faktorer som aktiverar medfödda T-celler snabbt 12,13,14. Med utgångspunkt i detta resultat syftar denna kontaktfria air-liquid interface (ALI) samodlingsmodell till att efterlikna de tidiga kemiska interaktionerna (medierade av lösliga faktorer som frigörs av det infekterade epitelskiktet) mellan det infekterade nasala epitelskiktet och PBMC under tidig infektion. Den fysiska separationen mellan det nasala epitelskiktet (odlat på membraninsatser) och PBMC (i kammaren under) och epitelintegriteten förhindrar direkt infektion av PBMC av viruset, vilket möjliggör en detaljerad studie av effekterna av epitel-härledda lösliga faktorer på PBMC: erna. De identifierade faktorerna kan därför undersökas ytterligare för deras terapeutiska potential att inducera lämplig medfödd T-cellspopulation som kan skydda mot influensainfektion. Detta dokument har därför detaljerat metoderna för att upprätta en samkultur för studier av medfödd T-cellaktivering från epitel-härledda lösliga faktorer.
Medfödda immunsvar mot virus är ett underunderstuderat studieområde inom antiviral hantering. Luftvägarnas epitelceller och medfödda immunceller arbetar i samförstånd för att undertrycka viral replikation under en infektion, förutom att fungera som en determinant för överaktivt adaptivt svar om virusbelastningen inte hålls i schack 12,13,17. Utvecklingen av en relevant mänsklig modell för studier av epitel-medfödd…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka forskningspersonalen vid NUS Department of Otolaryngology och Institutionen för mikrobiologi och immunologi för deras hjälp med hNEC:s kultur- och viruskulturrelaterade arbete. Vi vill också tacka kirurgerna och det kirurgiska teamet vid National University Hospital, Department of Otolaryngology, för deras hjälp med att tillhandahålla de cell- och blodprover som krävs för studien.
Denna studie finansierades av National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (till De Yun Wang) och MOH-OFYIRG19may-0007 (till Kai Sen Tan). Kai Sen Tan är mottagare av stipendiestöd från European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
12-well Plate | Corning | 3513 | |
12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
24-well Plate | Corning | 3524 | |
24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
Crystal Violet | Merck | C6158 | |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
hNESPCs | Human Donors | NA | |
Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
T25 Flask | Corning | 430639 | |
T75 Flask | Corning | 430641U | |
TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |