Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen viral infizierten Nasenepithelzellen und der angeborenen Zellaktivierung. Einzelne Untergruppen von Immunzellen können anhand ihrer Aktivierung als Reaktion auf Virusinfektionen unterschieden werden. Sie können dann weiter untersucht werden, um ihre Auswirkungen auf frühe antivirale Reaktionen zu bestimmen.

Abstract

Die frühen Wechselwirkungen zwischen der Nasenepithelschicht und den angeborenen Immunzellen während viraler Infektionen bleiben ein wenig erforschtes Gebiet. Die Bedeutung der angeborenen Immunitätssignalisierung bei Virusinfektionen hat erheblich zugenommen, da Patienten mit Atemwegsinfektionen, die eine hohe angeborene T-Zell-Aktivierung aufweisen, ein besseres Krankheitsergebnis zeigen. Daher ermöglicht die Sezierung dieser frühen angeborenen Immuninteraktionen die Aufklärung der Prozesse, die sie steuern, und kann die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele und Strategien zur Dämpfung oder sogar Verhinderung des frühen Fortschreitens von Virusinfektionen erleichtern. Dieses Protokoll beschreibt ein vielseitiges Modell, mit dem frühe Übersprechen, Interaktionen und die Aktivierung angeborener Immunzellen aus Faktoren, die von viral infizierten Atemwegsepithelzellen abgesondert werden, untersucht werden können. Unter Verwendung eines H3N2-Influenzavirus (A/Aichi/2/1968) als repräsentatives Virusmodell wurde die angeborene Zellaktivierung von kokultivierten mononukleären Zellen im peripheren Blut (PBMCs) mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Untergruppen von Zellen zu untersuchen, die durch die löslichen Faktoren aktiviert werden, die als Reaktion auf die Virusinfektion aus dem Epithel freigesetzt werden. Die Ergebnisse demonstrieren die Gating-Strategie zur Differenzierung der Teilmengen von Zellen und zeigen die deutlichen Unterschiede zwischen den aktivierten Populationen von PBMCs und ihrem Crosstalk mit dem Kontroll- und infizierten Epithel. Die aktivierten Teilmengen können dann weiter analysiert werden, um ihre Funktionen sowie die für die Zellen spezifischen molekularen Veränderungen zu bestimmen. Die Ergebnisse einer solchen Crosstalk-Untersuchung können Faktoren aufdecken, die für die Aktivierung lebenswichtiger angeborener Zellpopulationen wichtig sind und für die Kontrolle und Unterdrückung des Fortschreitens der Virusinfektion von Vorteil sind. Darüber hinaus können diese Faktoren universell auf verschiedene Viruserkrankungen angewendet werden, insbesondere auf neu auftretende Viren, um die Auswirkungen solcher Viren zu dämpfen, wenn sie zum ersten Mal in naiven menschlichen Populationen zirkulieren.

Introduction

Atemwegsviren gehören vielleicht zu den am weitesten verbreiteten Krankheitserregern, die eine schwere Belastung für die Gesundheitsversorgung und die Wirtschaft verursachen. Von den periodischen globalen Ausbrüchen neu auftretender epidemischer Stämme (z. B. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) bis hin zu den saisonalen Influenzastämmen jedes Jahr sind Viren eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Obwohl Impfstoffe den Hauptteil der Reaktion auf diese globalen Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit ausmachen, ist es ernüchternd festzustellen, dass diese Gegenmaßnahmen lediglich reaktionsschnell^{sind 1,2}. Darüber hinaus ist eine Verzögerung zwischen dem Auftreten eines neuen infektiösen Stammes und der erfolgreichen Entwicklung seines Impfstoffs^{unvermeidlich 3,} was zu einer Zeit führt, in der die verfügbaren Maßnahmen zur Eindämmung der Ausbreitung des Virus stark begrenzt sind.

Diese Verzögerungen werden durch die Kosten, die der Gesellschaft – wirtschaftlich und sozial – entstehen, noch verstärkt. Allein die saisonale Grippe ist für etwa 8 Milliarden US-Dollar an indirekten Kosten, 3,2 Milliarden US-Dollar an medizinischen Kosten und 36,3.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten von Amerika jährlich^{verantwortlich 4}. Dies geschieht vor der Berücksichtigung der Forschungskosten, die zur Finanzierung der Impfstoffentwicklung erforderlich sind. Epidemieausbrüche haben noch schwerwiegendere Auswirkungen auf die Gesellschaft, verstärkt durch die von Jahr zu Jahr zunehmende Globalisierungsrate, wie die globalen Störungen zeigen, die durch die Entstehung und schnelle Ausbreitung des schweren Coronovirus 2 (SARS-CoV-2) ^5,6,7 verursacht werden.

Neuere Studien haben gezeigt, dass infizierte Patienten mit einer größeren Population von aktivierten angeborenen T-Zellen tendenziell ein besseres Krankheitsergebnis haben ^8,9,10. Darüber hinaus wird die angeborene T-Zellpopulation in mehrere Untergruppen eingeteilt: die schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), Vδ1 γδ T-Zellen, Vδ2 γδ T-Zellen und die natürlichen Killer-T-Zellen (NKT). Diese Untergruppen angeborener T-Zellen weisen auch eine Heterogenität innerhalb ihrer Populationen auf, was die Komplexität der Interaktionen zwischen den Zellpopulationen, die an der angeborenen Immunantwort beteiligt sind^{, erhöht 11}. Daher kann der Mechanismus, der diese angeborenen T-Zellen aktiviert, und das Wissen über die spezifischen Untergruppen angeborener T-Zellen einen anderen Forschungsweg bieten, um die infektiösen Auswirkungen dieser Viren auf den menschlichen Wirt einzudämmen, insbesondere während der Zeit der Impfstoffentwicklung.

Epithelzellen, die mit Influenza infiziert sind, produzieren Faktoren, die angeborene T-Zellen schnell aktivieren^12,13,14. Aufbauend auf diesem Befund zielt dieses kontaktlose Luft-Flüssig-Grenzflächenmodell (ALI) darauf ab, die frühen chemischen Wechselwirkungen (vermittelt durch lösliche Faktoren, die von der infizierten Epithelschicht freigesetzt werden) zwischen der infizierten Nasenepithelschicht und den PBMCs während einer frühen Infektion nachzuahmen. Die physikalische Trennung zwischen der Nasenepithelschicht (kultiviert auf Membraneinsätzen) und den PBMCs (in der darunter liegenden Kammer) und der epithelialen Integrität verhindert eine direkte Infektion der PBMCs durch das Virus und ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Auswirkungen von epithelial abgeleiteten löslichen Faktoren auf die PBMCs. Die identifizierten Faktoren können daher hinsichtlich ihres therapeutischen Potenzials bei der Induktion der geeigneten angeborenen T-Zell-Population, die vor einer Influenza-Infektion schützen kann, weiter untersucht werden. Dieses Papier hat daher die Methoden zur Etablierung einer Kokultur für die Untersuchung der angeborenen T-Zell-Aktivierung aus Epithel-abgeleiteten löslichen Faktoren detailliert beschrieben.

Protocol

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte der in diesem Protokoll verwendeten Medien.HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass hNECS, die auf 12-Well Transwell gezüchtet werden, in eine optimalere Dicke für lösliche Faktoren wachsen, um die Basalkammer leicht zu erreichen, wenn sie mit dem Influenzavirus infiziert sind. Daher wird die Verwendung von 12-Well-Size-Transwell für die Kokultur empfohlen. 1. Aufbau der 3T3-Feederschicht Betrieb aus Tiefkühlbestände…

Representative Results

Obwohl konventionelle T-Zellen das Hauptrepertoire der adaptiven Immunantwort gegen Virusinfektionen bilden, um die virale Clearance zu erleichtern, arbeitet die angeborene T-Zell-Population über ein breiteres Spektrum, um die Viruslast für eine effektive Clearance in einem späteren Stadium zu unterdrücken. Daher schafft dieses Protokoll speziell eine robuste Bedingung, um angeborene T-Zellen, ihre Aktivierung und ihre funktionelle Population nach einer Influenza-Infektion zu untersuc…

Discussion

Angeborene Immunantworten gegen Viren sind ein wenig erforschtes Forschungsgebiet im antiviralen Management. Die Epithelzellen der Atemwege und die angeborenen Immunzellen arbeiten zusammen, um die Virusreplikation während einer Infektion zu unterdrücken, und dienen nicht nur als Determinante der überaktiven adaptiven Reaktion, wenn die Viruslast nicht in Schach gehalten^{wird 12,13,17}. Die Entwicklung eines relevanten Humanmod…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894