Denne protokol beskriver en undersøgelse af de tidlige interaktioner mellem viralt inficerede nasale epitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper af immunceller kan skelnes ud fra deres aktivering som reaktion på virusinfektioner. De kan derefter undersøges yderligere for at bestemme deres virkninger på tidlige antivirale reaktioner.
De tidlige interaktioner mellem næseepitellaget og de medfødte immunceller under virusinfektioner forbliver et underudforsket område. Betydningen af medfødt immunitetssignalering i virusinfektioner er steget betydeligt, da patienter med luftvejsinfektioner, der udviser høj medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sygdomsresultat. Derfor tillader dissekering af disse tidlige medfødte immuninteraktioner belysning af de processer, der styrer dem, og kan lette udviklingen af potentielle terapeutiske mål og strategier til at dæmpe eller endda forhindre tidlig progression af virusinfektioner. Denne protokol beskriver en alsidig model, der kan bruges til at studere tidlig krydstale, interaktioner og aktivering af medfødte immunceller fra faktorer udskilt af viralt inficerede luftvejsepitelceller. Ved hjælp af en H3N2-influenzavirus (A/Aichi/2/1968) som den repræsentative virusmodel er medfødt celleaktivering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) blevet analyseret ved hjælp af flowcytometri for at undersøge de delmængder af celler, der aktiveres af de opløselige faktorer, der frigives fra epitelet som reaktion på virusinfektionen. Resultaterne demonstrerer gating-strategien til differentiering af delmængder af celler og afslører de klare forskelle mellem de aktiverede populationer af PBMC’er og deres krydstale med kontrol- og inficeret epitel. De aktiverede delmængder kan derefter analyseres yderligere for at bestemme deres funktioner såvel som molekylære ændringer, der er specifikke for cellerne. Resultater fra en sådan crosstalk-undersøgelse kan afdække faktorer, der er vigtige for aktiveringen af vitale medfødte cellepopulationer, som er gavnlige for at kontrollere og undertrykke udviklingen af virusinfektion. Desuden kan disse faktorer anvendes universelt på forskellige virussygdomme, især på nyopståede vira, for at dæmpe virkningen af sådanne vira, når de først cirkulerer i naive menneskelige populationer.
Respiratoriske vira er måske blandt de mest udbredte patogener, der forårsager alvorlig sundhedspleje og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale udbrud af nye epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sæsonbestemte influenzastammer hvert år er vira en konstant trussel mod folkesundheden. Selvom vacciner udgør hovedparten af svaret på disse globale folkesundhedsudfordringer, er det tankevækkende at bemærke, at disse modforanstaltninger kun erlydhøre 1,2. Desuden er en forsinkelse mellem fremkomsten af en ny smitsom stamme og den vellykkede udvikling af dens vaccine uundgåelig3, hvilket fører til en periode, hvor de foranstaltninger, der er til rådighed for at bremse spredningen af virusset, er stærkt begrænsede.
Disse forsinkelser understreges yderligere af de omkostninger, der påføres samfundet økonomisk og socialt. Sæsoninfluenzaen alene er ansvarlig for ca. 8 milliarder dollars i indirekte omkostninger, 3,2 milliarder dollars i medicinske omkostninger og 36,3 tusind dødsfald i USA årligt4. Dette er før overvejelse af de forskningsomkostninger, der er nødvendige for at finansiere vaccineudvikling. Epidemiske udbrud har endnu mere alvorlige virkninger på samfundet, forværret af den stigende globaliseringshastighed hvert år, som det fremgår af de globale forstyrrelser forårsaget af fremkomsten og hurtig spredning af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7.
Nylige undersøgelser har vist, at inficerede patienter med en større population af aktiverede medfødte T-celler har tendens til at have et bedre sygdomsresultat 8,9,10. Desuden er den medfødte T-cellepopulation kategoriseret i flere undergrupper: de slimhinde-associerede invariant t (MAIT) celler, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige dræber-T-celler (NKT). Disse undergrupper af medfødte T-celler udviser også heterogenitet inden for deres populationer, hvilket øger kompleksiteten af interaktionerne mellem de cellepopulationer, der er involveret i det medfødte immunrespons11. Derfor kan mekanismen, der aktiverer disse medfødte T-celler og kendskabet til de specifikke undergrupper af medfødte T-celler, give en anden forskningsvej for at begrænse de infektiøse virkninger af disse vira på den menneskelige vært, især i perioden med vaccineudvikling.
Epitelceller inficeret med influenza producerer faktorer, der aktiverer medfødte T-celler hurtigt 12,13,14. På baggrund af dette fund har denne kontaktfri Air-Liquid Interface (ALI) co-kulturmodel til formål at efterligne de tidlige kemiske interaktioner (medieret af opløselige faktorer frigivet af det inficerede epitellag) mellem det inficerede nasalepitellag og PBMC’erne under tidlig infektion. Den fysiske adskillelse mellem næseepitellaget (dyrket på membranindsatser) og PBMC’erne (i kammeret nedenunder) og epitelintegriteten forhindrer direkte infektion af PBMC’erne med virussen, hvilket muliggør en detaljeret undersøgelse af virkningerne af epitelafledte opløselige faktorer på PBMC’erne. De identificerede faktorer kan derfor undersøges yderligere for deres terapeutiske potentiale til at fremkalde den passende medfødte T-cellepopulation, der kan beskytte mod influenzainfektion. Dette papir har derfor detaljeret beskrevet metoderne til etablering af en co-kultur til undersøgelse af medfødt T-celleaktivering fra epitelafledte opløselige faktorer.
Medfødte immunresponser mod vira er et underunderstuderet fagområde inden for antiviral behandling. Luftvejsepitelcellerne og medfødte immunceller arbejder sammen for at undertrykke viral replikation under en infektion, udover at tjene som en determinant for overaktiv adaptiv respons, hvis den virale belastning ikke holdes i skak 12,13,17. Udviklingen af en relevant human model til undersøgelse af epitel-medfødt immunkrydst…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke forskerstaben i NUS Otolaryngologisk Afdeling og Institut for Mikrobiologi og Immunologi for deres hjælp med hNEC kultur- og viruskulturrelateret arbejde. Vi vil også gerne takke kirurgerne og det kirurgiske team på Rigshospitalet, Otolaryngologisk Afdeling, for deres hjælp med at levere de celle- og blodprøver, der kræves til undersøgelsen.
Denne undersøgelse blev finansieret af National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er modtager af stipendiestøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
12-well Plate | Corning | 3513 | |
12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
24-well Plate | Corning | 3524 | |
24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
Crystal Violet | Merck | C6158 | |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
hNESPCs | Human Donors | NA | |
Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
Insulin | Sigma | I3536 | |
Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
T25 Flask | Corning | 430639 | |
T75 Flask | Corning | 430641U | |
TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |