Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

كامل جبل تلطيخ، والتصور، وتحليل الفطريات، Circumvallate، وبراعم طعم الحنك

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

تصف هذه الورقة طرق إعداد الأنسجة ، وتلطيخ ، وتحليل براعم طعم الفطريات والحواف والحنك الكاملة والناعمة التي تنتج باستمرار براعم الذوق الكاملة وال سليمة (بما في ذلك الألياف العصبية التي ت الداخلي لهم) والحفاظ على العلاقات بين الهياكل داخل براعم الذوق والبابيات المحيطة بها.

Abstract

براعم الذوق هي مجموعات من الخلايا تحويل الذوق المتخصصة للكشف عن مجموعات فرعية من المحفزات الكيميائية في تجويف الفم. هذه الخلايا المحولة تتواصل مع الألياف العصبية التي تحمل هذه المعلومات إلى الدماغ. ولأن خلايا تحويل الطعم تموت باستمرار ويتم استبدالها طوال مرحلة البلوغ، فإن بيئة برعم الذوق معقدة وديناميكية على حد سواء، وتتطلب تحليلات مفصلة لأنواع خلاياها ومواقعها وأي علاقات جسدية بينها. وقد تم الحد من التحليلات التفصيلية من خلال عدم التجانس والكثافة في أنسجة اللسان التي خفضت بشكل كبير نفاذية الأجسام المضادة. تتطلب هذه العقبات بروتوكولات تقسيم تؤدي إلى تقسيم براعم الذوق عبر المقاطع بحيث يتم تقريب القياسات فقط، وفقدان علاقات الخلية. للتغلب على هذه التحديات ، تتضمن الطرق الموصوفة هنا جمع وتصوير وتحليل براعم الذوق الكاملة وال اربوريس المحطة الفردية من ثلاث مناطق طعم: الحليمة الفطرية ، الحليمة المحيطة ، والحنك. جمع براعم الذوق كله يقلل من التحيز والتباين التقني ويمكن استخدامها للإبلاغ عن الأرقام المطلقة للميزات بما في ذلك حجم الذوق برعم، مجموع الذوق برعم الداخلية، نقل عدد الخلايا، ومورفولوجيا من أربور المحطة الطرفية الفردية. لإثبات مزايا هذه الطريقة ، توفر هذه الورقة مقارنات بين برعم الذوق وأحجام الداخليا بين براعم الذوق الفطرية والحواف باستخدام علامة عامة لبراعم الذوق وتسمية لجميع ألياف الذوق. كما يتم توفير سير عمل لاستخدام الوسم الوراثي للخلايا المتناثرة للخلايا العصبية المذاق (مع مجموعات فرعية تحمل علامات من خلايا تحويل الذوق). هذا سير العمل يحلل هياكل الفردية المشتلات الذوق العصب ، وأرقام نوع الخلية ، والعلاقات المادية بين الخلايا باستخدام برنامج تحليل الصور. معا، توفر هذه سير العمل نهجا جديدا لإعداد الأنسجة وتحليل كل من براعم الذوق كله ومورفولوجيا كاملة من أربور الداخلية الخاصة بهم.

Introduction

براعم الذوق هي مجموعات من 50-100 الخلايا الظهارية المتخصصة التي تربط مجموعات فرعية من المحفزات الكيميائية الذوق موجودة في تجويف الفم. ويعتقد عموما خلايا تحويل الذوق إلى وجود أنواع1،2، 3،4،5،6،7،8،9، في البداية على أساس معايير المجهر الإلكتروني التي كانت مرتبطة في وقت لاحق مع علامات الجزيئية. النوع الثاني الخلايا التعبير عن فوسفوليباز C-بيتا 2 (PLCβ2)2 و العابرة مستقبلات قناة cation المحتملة, subfamily M عضو 51 وتشمل الخلايا التي تنقل الحلو, مريرة, وumami1,10. الخلايا من النوع الثالث تعبر عن أنهيدراز الكربوني 4 (Car4)11 والبروتين المرتبط بالسيبتوسوم 258 وتدل على الخلايا التي تستجيب في المقام الأول للذوق الحامض11. الخلايا التي تحول الملوحة لم تكن واضحة كما رسمتبوضوح 12,13,14, ولكن يمكن أن تشمل يحتمل أن النوع الأول, نوع الثاني والنوع الثالث خلايا15,16,17,18,19. بيئة الذوق برعم معقدة وديناميكية، بالنظر إلى أن الخلايا تحويل الذوق تتحول باستمرار على مدى مرحلة البلوغ ويتم استبدالها من قبل السلف القاعدية3،20،21. هذه الخلايا تحويل الذوق الاتصال الألياف العصبية أحادية القطب الزائفة من العقدة geniculate وال بتروسال، والتي تمر معلومات الذوق إلى جذع الدماغ. وقد صنفت هذه الخلايا العصبية في المقام الأول على أساس نوع من المعلومات طعم أنها تحمل22,23 لأن المعلومات حول مورفولوجيا كانت بعيدة المنال حتى وقت قريب24. النوع الثاني الخلايا التواصل مع الألياف العصبية عن طريق البروتين معامل الكالسيوم 1 قنوات أيون25، في حين أن الخلايا من النوع الثالث التواصل عبر نقاط الاشتباك العصبي الكلاسيكية8،26. مزيد من التوصيف لخلايا برعم الذوق بما في ذلك نقل أنواع الخلايا الأنساب، والعوامل التي تؤثر على تمايزها، وهياكل ربط أربور كلها مجالات التحقيق النشط.

وقد أعاقت العديد من التحديات التقنية دراسات الذوق. الأنسجة غير المتجانسة والكثيفة التي تشكل اللسان تقلل بشكل كبير من نفاذية الأجسام المضادة للكيمياء المناعية27،28،29. وقد استلزمت هذه العقبات تقسيم البروتوكولات التي تؤدي إلى تقسيم براعم الذوق عبر الأقسام بحيث يتم تقريب القياسات إما على أساس الأقسام التمثيلية أو تلخيصها عبر الأقسام. سابقا، تم استخدام المقاطع رفيعة تمثيلية لتقريب كل من قيم وحدة التخزين وتعول الخلايا المحولة30. يسمح القسم التسلسلي الأكثر سمكا بتصوير جميع أقسام برعم الذوق وتجميع القياسات من كل قسم31. قطع مثل هذه المقاطع سميكة واختيار براعم الذوق كله فقط التحيزات أخذ العينات نحو أصغر براعم الذوق32،33،34. وقد استندت تقديرات الأعصاب الداخلية من براعم الذوق المقطعية على تحليلات أرقام بكسل13،35، إذا تم قياسها كميا في جميع36،37،38. تتجاهل هذه القياسات تماما بنية وعدد أربور الأعصاب الفردية ، لأن الأشجار تنقسم (وعادة ما تكون سيئة التسمية). وأخيرا، على الرغم من تقشير بعيدا الظهارة لا تسمح براعم الذوق بأكملها لتكون ملطخة39،40، فإنه يزيل أيضا الألياف العصبية الذوق برعم ويمكن أن تعطل العلاقات الطبيعية بين الخلايا. لذلك ، كانت التحقيقات في العلاقات الهيكلية داخل براعم الذوق محدودة بسبب هذا الاضطراب الناجم عن نهج التلطيخ.

جمع كامل الهيكل يلغي الحاجة إلى أقسام تمثيلية ويسمح بتحديد قياسات القيمة المطلقة للأحجام، عدد الخلايا، ومورفولوجيا الهيكل41. كما أن هذا النهج يزيد من الدقة ويحد من التحيز ويقلل من التباين التقني. هذا العنصر الأخير مهم لأن براعم الذوق تظهر تباينا بيولوجيا كبيرا داخل34و42 وعبر المناطق43و44، وتسمح تحليلات برعم الذوق الكامل بمقارنة أرقام الخلايا المطلقة بين التحكم والظروف التجريبية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على جمع براعم الذوق سليمة يسمح تحليل العلاقات الفيزيائية بين مختلف الخلايا المحولة والألياف العصبية المرتبطة بها. لأن خلايا تحويل الذوق قد تتواصل مع بعضها البعض45 والتواصل مع الألياف العصبية46, هذه العلاقات مهمة للوظيفة العادية. وبالتالي، قد لا تكون ظروف فقدان الوظيفة بسبب فقدان الخلايا، ولكن بدلا من ذلك إلى تغييرات في علاقات الخلية. تقدم هنا طريقة لجمع براعم الذوق كله لتحقيق فوائد القياسات المطلقة لتحليل حجم التكرير لكل من براعم الذوق وداخلياتها، وأعداد خلايا الذوق والأشكال، وتسهيل تحليلات العلاقات بين الخلايا العابرة ومورفولوجيا الأعصاب. كما يتم تقديم اثنين من سير العمل المصب من هذه الطريقة الجديدة جبل كامل لإعداد الأنسجة: 1) لتحليل حجم برعم الذوق والا الداخلي الكلي و 2) لوضع العلامات الوراثية متناثرة الخلية من الخلايا العصبية الذوق (مع مجموعات فرعية من الخلايا تحويل الذوق المسمى) والتحليلات اللاحقة من مورفولوجيا المشتل الأعصاب الذوق، أعداد أنواع خلايا التذوق وأشكالها، واستخدام برامج تحليل الصور لتحليل العلاقات الفيزيائية بين الخلايا المحولة وتلك بين التحويل الخلايا و أربور الأعصاب. معا، توفر هذه مسارات العمل نهجا جديدا لإعداد الأنسجة وتحليلات براعم الذوق كله ومورفولوجيا كاملة من أربور الداخلية الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم رعاية جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها سياسة خدمة الصحة العامة الأمريكية بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر ودليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. Phox2b-Cre الفئران (MMRRC سلالة 034613-UCD، NP91Gsat/Mmcd) أو TrkBكريتر الفئران (Ntrk2tm3.1 (cre/ERT2)Ddg) ولدت مع الفئران مراسل tdTomato (Ai14). ولدتأدفلينرير47 مع Phox2b-flpo48 وAi65. لحقن 5-إيثينيل-2′-deoxyuridine (EdU) , تم إعداد EdU وتحسب الجرعات وفقا لبيريامارتينيز وآخرون.

1. إعداد المواد

  1. إعداد الحلول
    1. حل 5.244 غرام من فوسفات الصوديوم أحادية الباسيك و 23.004 غرام من فوسفات الصوديوم ديباسيك في الماء المقطر المزدوج (ddH2O) على لوحة اثارة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، وبذلك إجمالي حجم للحصول على 1 لتر من 0.2 متر الصوديوم الفوسفات العازلة (PB).
    2. حل paraformaldehyde في ddH2O في غطاء الدخان عن طريق التدفئة أثناء التحريك على لوحة ضجة حتى يصل الحل إلى 90 درجة مئوية. إضافة 4 M NaOH حل دروبيا لتصفية paraformaldehyde، وتصفية الحل باستخدام فراغ قارورة Erlenmeyer ومرشح السيراميك مع ورقة التصفية. إضافة حجم يساوي 0.2 M PB، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 للحصول على 4٪ PFA في 0.1 M PB.

2. إعداد الأنسجة

  1. جمع الأنسجة
    1. الفئران التضحية باستخدام جرعة زائدة مخدر مع محلول العمل التي تحتوي على 10 مل من المالحة المعقمة و 0.25 مل من محلول الأسهم التي تحتوي على 5 غرام من 2،2،2-tribromoethanol و 5 مل من الكحول tert-أميل. Perfuse عبر القلب مع 4٪ PFA في 0.1 M PB؛ إزالة الألسنة والحنك.
    2. عزل براعم الذوق circumvallate باستخدام قطع التاجية التي تفصل بين اللسان الخلفي، وراء سماحة بين النجوم. قطع براعم الذوق مع شفرة حلاقة. ثم يقسم اللسان الأمامي عند خط الوسط. بعد الإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع 4٪ PFA في 0.1 M PB.
    3. Cryoprotect الأنسجة في 30٪ السكروز بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تجميد الأنسجة في درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) مركب باستخدام 2-ميثيلبوتان مبردة في كوب على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية إذا كان الإجراء يجب أن تتوقف هنا.
  2. براعم الذوق الفطرية
    1. البرد 2-ميثيلبوتان في كوب على الجليد الجاف استعدادا للخطوة 2.2.8.
    2. تذوب وتشطف اللسان في 0.1 M PB. ضع نصف اللسان الأمامي الذي يحتوي على الحليمة الفطرية على شريحة زجاجية تحت مجهر تشريح.
    3. استخدام ملقط حادة النهاية ومقص تشريح لإزالة العضلات. استخدم ملقط حاد النهاية لإبقاء الأنسجة مفتوحة مع انحناء الظهارة اللغوية ، وضمان اتجاه مسطح عن طريق الحفاظ على شفرات مقص التشريح الخشن الموازي للظهارة.
    4. تجاهل البطينية غير الكيراتينية ظهارة اللسان لأنه لا يحتوي على براعم الذوق.
    5. استخدام مقص تشريح غرامة لتشريح أقرب إلى الجانب السفلي من الظهارة الكيراتينية.
      ملاحظة: من المهم تشريح قريبة من الظهارة بحيث تكون العضلات المتبقية من سمك موحد، والسطح على نحو سلس لضمان اختراق الأجسام المضادة موحدة. ستكون نتيجة سمك العضلات المتبقية غير الموحدة متفاوتة في الكريوستات ، مع التعرض للظهارة في المناطق ذات العضلات الأقل وطبقة أكثر سمكا من العضلات للمناطق الأخرى ، مما يعوق اختراق الأجسام المضادة.
    6. استخدام ملقط حادة انتهت لوضع قطعة من الظهارة في قالب الأنسجة (الجانب العضلي إلى أسفل)، وضمان أنه يضع شقة. بمجرد أن يصبح النسيج مسطحا ، أضف قطرة من OCT إلى الأنسجة.
      ملاحظة: نظرا لأن طرف اللسان منحني، قد يكون من الضروري إجراء قطع في الظهارة حيث يتم منحني بحيث يمكن جعل الأنسجة لوضع شقة.
    7. ضع قالب الأنسجة على قاعدة معدنية (تم تبريده سابقا في الثلج الجاف) تحت نطاق التشريح. الاستمرار في الاستفادة من الأنسجة طفيفة مع ملقط حتى أكتوبر قد جمدت لضمان تجميد الأنسجة مسطحة قدر الإمكان.
    8. مرة واحدة وقد جمدت أكتوبر، إضافة بسرعة أكتوبر إضافية، ووضع القالب في كوب من 2-ميثيل بوتان (تبريده في الجليد الجاف) حتى المجمدة.
    9. تقسيم نظام المعلومات التجارية Cryostat
      ملاحظة: يستخدم cryostat لإزالة الأنسجة تحت الجلد المتبقية، والتي قد تمنع اختراق الأجسام المضادة(الشكل 1).
      1. جبل قوالب أكتوبر على cryostat، وقطع أقسام 20 ميكرومتر. جمع كل قسم، وعرضه تحت المجهر الخفيف لتقييم قربها من قاعدة الظهارة (الشكل 1E - H).
      2. بعد حلق الأنسجة من الجانب السفلي من الظهارة ، قم بإذابة الظهارة وشطفها مرتين في 0.1 M PB على شاكر.
  3. براعم الذوق المحيطة
    1. باستخدام قطع تاجي مع شفرة حلاقة، افصل الحليمة المحيطة عن اللسان الأمامي. استخدام اثنين من قطع parasagittal مع نفس شفرة الحلاقة لإزالة الأنسجة الجانبية إلى الحليمة تحت نطاق تشريح. ضع الحليمة في قالب نسيج باستخدام ملقط بحيث تواجه حافة واحدة من الحليمة المحيطة أسفل قالب الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن تجميد الأنسجة في أكتوبر باستخدام 2-ميثيلبوتان مبردة في كوب على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية إذا كان الإجراء يجب أن يتوقف هنا.
    2. قطع الأنسجة إلى أقسام عائمة 90 ميكرومتر على cryostat.
  4. براعم الذوق على الحنك
    1. قطع الأمامية الحنك الصلب إلى تقاطع الحنك لينة ويصعب (الشكل 2). استخدم مقصا لفصل الحنك الرخو عن الأنسجة الأساسية، مع التأكد من قطع أي شظايا عظمية متبقية. إزالة العضلات إضافية والأنسجة الضامة.
      ملاحظة: بمجرد إزالتها، فإن جميع الأنسجة المتبقية تتكون من الغدد والأنسجة الضامة الفضفاضة، والتي يتم الالتزام بها بخفة إلى الجانب السفلي من الحنك.
    2. عقد الحنك مع ملقط حادة النهاية، وإزالة الغدد المتبقية والأنسجة الضامة فضفاضة عن طريق كشط بلطف لهم مع شفرة حلاقة.
      ملاحظة: يمكن تجميد الأنسجة في أكتوبر باستخدام 2-ميثيلبوتان مبردة في كوب على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية إذا كان الإجراء يجب أن يتوقف هنا.

3. الكيمياء المناعية تلطيخ

  1. غسل الأنسجة مع 0.1 M PB, 3 × 15 دقيقة. ضع الأنسجة في أنابيب 1 مل مع حل الحجب (3٪ مصل حمار، 0.5٪ غير أيونية السطحي (انظر جدول المواد)، 0.1 M PB) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إزالة الحل حجب، واحتضان الأنسجة في الأجسام المضادة الأولية (أرنب المضادة PCLβ2) في حل الأجسام المضادة (0.1 M PB، 0.5٪ غير الأيونية السطحي) لمدة 5 أيام في 4 درجة مئوية.
  3. يغسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة كل غسل، واحتضان في حمار الثانوية المضادة للأرنب 488 الأجسام المضادة (1:500) في حل الأجسام المضادة لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية.
  4. يغسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة كل غسل، وكتلة مع مصل أرنب طبيعي 5٪ في حل الأجسام المضادة.
  5. غسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة. احتضان مع حمار المضادة للأرانب حجب الأجسام المضادة (20 ميكروغرام / مل) في حل الأجسام المضادة لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية.
  6. غسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة كل غسل، ومن ثم احتضان مع الأجسام المضادة الأولية dsRed (أرنب) المقترنة تسمية الفلورسنت (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في حل الأجسام المضادة لمدة 5 أيام في 4 درجة مئوية.
  7. غسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة كل غسل، ومن ثم احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (الماعز المضادة Car4 (1:500)) في حل الأجسام المضادة لمدة 5 أيام في 4 درجة مئوية.
  8. يغسل مع 0.1 M PB، 4 × 15 دقيقة كل غسل. احتضان مع حمار ثانوي المضادة للماعز 647 الأجسام المضادة (1:500) في حل الأجسام المضادة لمدة 2 أيام في 4 °C.
  9. غسل مع 0.1 M PB, 4 × 15 دقيقة كل غسل, وجبل (الجانب الظهاري حتى) في وسائل الإعلام تصاعد مائي, ووضع غطاء على قسم الأنسجة.
    ملاحظة: إذا كان استخدام الأجسام المضادة من أنواع مختلفة، كما هو الحال مع الكيراتين-8 و dsRed فقط، إضافة جميع الأجسام المضادة الأولية إلى حل الأجسام المضادة في الخطوة 3.2 وجميع الأجسام المضادة الثانوية في الخطوة 3.3 قبل الشروع في الخطوة 3.9.

4. التصوير الكونفوجال وdeonvolution

  1. التقاط الصور confocal باستخدام المجهر confocal مع هدف 60x (الفتحة العددية = 1.40) ، 4 مللي ثانية / بكسل ، والتكبير من 3 ، كالمان من 2 ، وحجم 1024 × 1024. حدد حجم خطوة 0.47 مم على طول المحور z. لالتقاط ال داخل الحليمة، استخدم تكبير 2.5 إذا كان مجال الرؤية مع التكبير من 3 ضيقة جدا لالتقاط كل ال داخل إلى الحليمة.
  2. لdeonvolute الصور، لاحظ أن بعض الإعدادات سوف استيراد تلقائيا مع الصورة. لذلك، ملء التفاصيل المتبقية عن طريقة، عدسة الهدف، الفتحة العددية، متوسط الغمر، عينة المتوسطة، والفلوروفوريس القبض في الصورة. ثم حدد Deconvolution ثلاثي الأبعاد.

5. تحليل الصور

  1. طعم برعم وحجم ال الداخلي
    1. استيراد مكدسات الصور غير المعقدة إلى برنامج تحليل الصور المستندة إلى بكسل (انظر جدول المواد)لتحديد حجم برعم الذوق وحجم التداعي الكلي داخل برعم الذوق.
      1. إلغاء تحديد مستوى الصوت في قائمة الكائن الرئيسي.
      2. حدد إضافة أسطح جديدة من القائمة كائن. حدد تخطي الإنشاء التلقائي، والتحرير يدويا،ثم حدد Contour.
      3. انقر على حدد ولاحظ السهم الذي يظهر ك + للمساعدة في تتبع حدود برعم الذوق. تحريك تقطيع شرائح ومخطط برعم الذوق في كل قسم البصرية. بمجرد اكتمال الملامح، انقر على إنشاء سطح.
      4. مراقبة كائن وحدة التخزين taste-bud تظهر الآن في القائمة الكائن الرئيسي. حدد حجم برعم الذوق تحت أدوات.
    2. حجم ال داخل براعم الذوق
      1. حدد رمز القلم الرصاص تحت كائن برعم الذوق، ثم حدد قناع الكل.
      2. في القائمة المنسدلة، حدد القناة الفلورية التي تتوافق مع ملصق الألياف العصبية. تحقق من إنشاء قناة مكررة.
      3. حدد تعيين voxels خارج السطح إلى:، واكتب 0 في المربع.
      4. لاحظ القناة الجديدة التي تظهر في إطار تعديل الشاشة، وهي نسخة مكررة غير معدلة من قناة الفلورسنت المحددة داخل برعم الذوق.
      5. في القائمة الكائن الرئيسي، حدد إنشاء سطح جديد. ألغ تحديد تخطي الإنشاء التلقائي، والتحرير يدويا.
      6. انقر مرتين على السهم الأزرق للمتابعة إلى الخطوة التالية.
      7. انقر على حذف، ثم انقر على السهم الأخضر المزدوج لإكمال السطح ، والذي يمثل حجم الألياف العصبية الموجودة داخل برعم الذوق. للبحث عن قيمة وحدة التخزين، حدد أدوات ضمن قائمة كائن الألياف العصبية، وحدد Volume (مستوى الصوت) من القائمة المنسدلة.
    3. حجم ال الداخلي إلى الحليمة
      1. إنشاء حجم من برعم الذوق كما هو موضح في القسم 5.1.
      2. حدد رمز القلم الرصاص تحت كائن الذوق برعم، ثم حدد قناع الكل.
      3. في القائمة المنسدلة، حدد القناة الفلورية التي تتوافق مع ملصق الألياف العصبية. تحقق من إنشاء قناة مكررة.
      4. حدد تعيين voxels داخل السطح إلى: واكتب 0 في المربع. انقر فوق موافق.
      5. إنشاء سطح بالنقر على إضافة سطح جديد. حدد مقطعا فقط منطقة الاهتمام.
      6. انقر على السهم الأزرق، وزيادة قيمة Z بحيث تبدأ منطقة الاهتمام في قاعدة برعم الذوق.
      7. انقر مرتين على السهم الأزرق للمتابعة إلى الخطوة التالية.
      8. انقر على حذف، ثم انقر على السهم الأخضر المزدوج لإكمال السطح ، والذي يمثل حجم التمين إلى الحليمة. للبحث عن قيمة وحدة التخزين، حدد أدوات ضمن قائمة كائن الألياف العصبية، وحدد Volume (مستوى الصوت) من القائمة المنسدلة.
    4. تحليل جهة اتصال الشجر الطرفي
      1. إعداد الصورة
        1. انتقل إلى القائمة تحرير وحدد اقتصاص ثلاثي الأبعاد. اقتصاص الصورة على جميع الجوانب، وإزالة الفضاء خارج برعم الذوق.
          ملاحظة: المحاصيل أقرب إلى برعم الذوق دون إزالة أي هيكل ذات الصلة أي صورة الزائدة سوف إطالة وقت المعالجة.
        2. حدد تحرير من القائمة الرئيسية، وانقر فوق تغيير نوع البيانات. حدد إلى: 32 بت تطفو من القائمة المنسدلة.
        3. حدد إضافة أسطح جديدة من القائمة كائن. انقر على تخطي إنشاء التلقائي، وتحرير يدويا،حدد كفاف،ثم اسحب موقف شريحة إلى اليمين للعثور على العدد الإجمالي للشرائح البصرية.
        4. إنشاء voxels متساوي القياس، وتأكد من أنه بدلا من voxels يجري المستطيلات (0.0691 × 0.0691 × 0.474) كما XxYxZ، على التوالي، voxels هي 0.0691 × 0.0691 × 0.0691 بتقسيم المستطيلات إلى مكعبات مع قيم متطابقة لكثافة الفلورية مثل voxel الأصلي المستطيل. حدد خصائص الصورة. ثم قسمة قيمة Z لحجم Voxel على قيمة X أو Y (= 0.474/0.0691) ثم ضرب هذه القيمة بعدد الشرائح (المقاطع البصرية) الموجودة في الخطوة السابقة.
        5. العودة إلى تحرير في القائمة الرئيسية، وحدد Resample 3D.
        6. استبدال قيمة Z (عدد الشرائح) بالقيمة المحسوبة حديثا.
      2. إنشاء أسطح أوتوماتيكية على أساس الفلورسينس
        1. انقر على إضافة سطح جديد مرة أخرى لإضافة سطح جديد، إلغاء تحديد الجزء فقط منطقة الاهتمام،وانقر على التالي.
        2. من القائمة المنسدلة قناة المصدر، حدد القناة لأحد أنواع الخلايا تحويل الذوق. إلغاء تحديد ناعم ومتابعة إلى الخطوة التالية.
        3. لا تغير أي شيء على الشاشة التالية يظهر نطاق كثافة الفلورسنت الموجودة في الصورة. انقر على السهم الأزرق في الأسفل مرة أخرى للانتقال إلى الخطوة التالية.
        4. انقر على حذف، ثم انقر على السهم الأخضر المزدوج لإكمال السطح.
        5. انتقل إلى القائمة كائن على اليد اليسرى من الشاشة حيث سطح الخلية المكتملة سوف تظهر وسوف تسمى شيئا عاما مثل سطح 2. انقر نقرا مزدوجا على اسم السطح لتسميته وفقا لما تمثله التسمية.
          ملاحظة: في هذه الحالة، يستند السطح الذي تم إنشاؤه إلى الخلية التي تحمل علامة PLCß2.
        6. إذا كانت هناك نقاط بدلا من سطح، ضمن القائمة في الزاوية اليسرى السفلى، انقر على سطح بدلا من نقطة المركز. ثم انقر فوق موافق عند المطالبة.
        7. كرر الخطوات 5.3.2.1-5.3.2.5 لعلامات الخلايا الأخرى التي يتم تحويل الطعم وعلامة الألياف العصبية.
        8. حفظ التقدم (تصديره).
        9. انقر على نوع الخلية Surface في القائمة الرئيسية. من قائمة هذا الكائن، انقر على أدوات،ثم انقر على تحويل المسافة.
        10. انتظر حتى يظهر مربع منبثق بعنوان XTDistanceTransformation. حدد خارج سطح الكائن. دون القناة الجديدة التي تظهر في القائمة تعديل العرض التي تسمى المسافة إلى اسم السطح.
        11. حدد سطح الألياف العصبية من قائمة الكائن. انقر على رمز قلم رصاص ثم قناع جميع.
        12. من القائمة المنسدلة التي تظهر، حدد المسافة القناة الجديدة إلى اسم السطح. دون القناة الجديدة التي تظهر في إطار تعديل العرض المسمى "المسافة المقنعة" إلى اسم السطح.
        13. إنشاء كائن جديد باستخدام القائمة الكائن الرئيسي. إلغاء تحديد الجزء فقط منطقة الاهتمام وانقر على السهم الأزرق. حدد المسافة المقنعة إلى قناة PLCß2 ثم قم بإلغاء تحديد ناعم.
        14. على الشاشة التالية، تحقق مما إذا كانت هناك أي مناطق حيث تكون خلايا تحويل الطعم ضمن أصغر مسافة من الألياف العصبية التي يمكن تمييزها من خلال هذا البرنامج. للقيام بذلك، تعيين حد من 0.01-0.11 ميكرومتر للتحقق من وجود أي فلورة الخلية مستقبلات هذا قريبة من الألياف العصبية.
        15. اكتب 0.01 في المربع الأخضر على الجانب الأيسر لتعيين العتبة السفلية، اضغط على Tab. ثم انقر على الزر الأحمر واكتب 0.11 لتعيين العتبة العليا. اضغط على Tab ثم انقر فوق السهم الأزرق في الأسفل للانتقال إلى الخطوة التالية.
        16. انقر على حذف ثم السهم المزدوج الأخضر لإنهاء.
        17. إعادة تسمية هذا السطح ضمن 0.01-0.11 من PLCß2 في القائمة كائن. حدد ضمن 0.01 - 0.11 من سطح PLCß2 في القائمة كائن.
        18. حدد قلم رصاص ثم انقر على قناع جميع. حدد القناة الحمراء (الألياف العصبية) من القائمة المنسدلة وانقر فوق موافق. دون القناة الجديدة التي تظهر في إطار تعديل العرض المسمى CHS2 المقنع.
        19. انقر على اسم القناة. إعادة تسمية القناة في غضون 0.01 - 0.11 من PLCß2.
          ملاحظة: هذه قناة فلورية تمثل نسخة مكررة من قناة الفلورسنت الحمراء الموجودة داخل السطح الذي تم إنشاؤه.
        20. انقر على الأبيض في منتصف محدد اللون. حدد لونا يتناقض مع ألوان البنيات.
        21. تصدير (أي حفظ) الملف في هذه المرحلة.
        22. كرر الخطوات 5.4.2.9-5.4.2.21 لعلامات الخلايا الأخرى التي يتم تحويل الطعم.
        23. تصدير (أي حفظ) الملف في هذه المرحلة.
          ملاحظة: لتحليل القرب من نوع خلية المسمى إلى آخر، ببساطة استبدال سطح الألياف العصبية في الخطوة 5.4.2.11 (والخطوات التالية) مع الكائن من الفائدة والمكونات المكافئة التي تتعلق كل الخطوات اللاحقة.

6. إعادة بناء الخلايا العصبية arbor وعدد الخلية المطلقة الكمي

  1. تعقب المشتل الطرفي وتحليله
    1. فتح ملف صورة deconvoluted في 3D ناقلات المستندة إلى برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد)،حدد تتبع،انقر على الخلايا العصبية،ومن ثم انقر على Dendrite.
    2. انتقل إلى قاعدة برعم الذوق في كومة الصورة. تتبع كل الألياف إلى النهاية أثناء التمرير من خلال كومة الصورة.
    3. عند نهاية الفرع، انقر بزر الماوس الأيمن على النهاية وحدد إنهاء. في نقاط الفرع، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عقدة Bifurcating.
      ملاحظة: هذا يتيح تتبع فرع واحد إلى النهاية ثم العودة إلى نقطة ثنائية وتعقب الفرع الآخر مع البرنامج التعرف على أن هذا التتبع لا يزال من نفس الخلايا العصبية.
    4. حفظ ملف البيانات كملف . DAT الملف، والتي يمكن فتحها بعد ذلك للتحليل في 3D ناقلات المستندة إلى برنامج تحليل الصور.

7. كمية عدد الخلايا

  1. تحديد حجم خلايا برعم الذوق المسمى في أي حزمة برامج تحليل الصور طالما علامات متميزة لأنواع الخلايا العابرة الراسية على موقف z يمكن وضعها على المستوى النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تلطيخ الظهارة اللغوية مع الأجسام المضادة لdsRed والكيراتين-8 (علامة الذوق برعم العام) وصفت كل من براعم الذوق كله وجميع التعصيب طعم برعم في Phox2b-Cre:tdTomato الفئران50،51 (الشكل 3A). أعطى التصوير هذه براعم الذوق من المسام إلى قواعدها أعلى دقة صور الطائرة س ص (الشكل 3A، ب). تم استخدام وظيفة كفاف برنامج التصوير القائم على البكسل لتحديد محيط برعم الذوق في كل قسم (الشكل 3B) ، ثم توليد سطح(الشكل 3C)يمثل حجم برعم الذوق. إخفاء (أو تكرار) الفلورسينس المرتبطة تسمية الذوق برعم فقط داخل السطح خلق قناة جديدة تحتوي فقط على هذا الفلورسينس والقضاء على أي تلطيخ الحليمة حجب برعم الذوق(الشكل 3D). تم إخفاء مضان الألياف العصبية داخل برعم الذوق(الشكل 3E)واستخدم لإنشاء سطح يمثل حجم ال داخله (الشكل 3F). كما تم استخدام نهج مماثل لقياس حجم الذوق برعم وذلك من التدبير المرتبطة بها في براعم الذوق circumvallate(الشكل 3G). لم تكشف بيانات القياس التمثيلية عن أي ارتباطات بين أحجام براعم الذوق وأحجام ال داخل أي من مناطق القياس(p = 0.115) أو المناطق المحيطة(p = 0.090)(الشكل 3H).

إدارة جرعة منخفضة من تاموكسيفين في TrkBCreER:الفئران tdTomato يسبب إعادة دمج الجينات ووضع العلامات على عدد قليل من الخلايا العصبية بحيث يتم تنشيط براعم الذوق من قبل صفر إلى عدد قليل من أربور المحطة الطرفية المسمى (الجزء العصبي داخل برعم الذوق). كانت الظهارة اللغوية ملطخة باستخدام جسم مضاد للdsRed لل أربور المحطة الطرفية والأجسام المضادة ل Car4 (الحامضة) ومكافحة PLCβ2 (الحلو والمر والأومامي) للخلايا تحويل الطعم(الشكل 4A). تم استخدام برنامج تحليل الصور المستندة إلى المتجهات لتتبع أربور المحطة الطرفية المسماة(الشكل 4B). وكانت الارتفاعات المتعامدة للرتل المرتبطة بتتبع الأزرق والأخضر 33.4 ميكرومتر(الشكل 4C)و 32.4 ميكرومتر(الشكل 4D)،على التوالي. وكانت قياسات الهيكل الحراري ثلاثي الأبعاد (أي مدى الشجرة الطرفية داخل برعم الذوق) للمرتل الطرفي الأزرق 644.0 ميكرومتر3 و 3647.0 ميكرومتر3 للمرتل الأخضر. يظهر مخطط ال dendrogram للتتبع الأخضر في الشكل 4E مع أطوال الفروع التي تقاس بالميكرونات. وكان المشجر الأخضر سبعة نهايات فرع ويبلغ إجمالي طولها 183.4 ميكرومتر. كشف القياس الكمي للأعداد المطلقة لخلايا PLCβ2+ و Car4+ أن برعم الذوق هذا يحتوي على 17 خلية PLCβ2 + وخلايا Car4+ اثنين. باستخدام خلية بكسل القائم على برنامج التصوير لتحديد أقرب القرب بين الألياف العصبية وخلايا تحويل الذوق كشفت أنه من أصل ما مجموعه 19 خلايا تحويل الذوق في برعم الذوق، أربور محطة زرقاء (هو مبين باللون الأحمر في الشكل 4F،G) كان ضمن 200 نانومتر (قرار المجهر الخفيف) من خلية Car4 + زرقاء فاتحة (المناطق البيضاء المشار إليها بالسهام في الشكل 4G). يظهر أربور المحطة المرتبطة تتبع الخضراء في أرجواني(الشكل 4F والشكل 4H) وهو ضمن 200 نانومتر من كل من ضوء والأزرق الداكن Car4 + الخلايا (المناطق البيضاء في الشكل 4H). كما كانت أقرب خلية تالية لهذه المشتلات على بعد أكثر من 200 نانومتر ، كان هناك voxel غير مصنف يفصل بين الهيكلين.

تم تصنيف الخلايا السلف التقسيمية باستخدام حقن EdU في الأيام 0 و 1 و 3 ، وتم جمع الأنسجة في اليوم 4. كامل جبل الكيراتين-8 وEdU تلطيخ براعم الذوق الفطريات كشفت أن الخلايا المسمى EdU كانت موجودة داخل وخارج براعم الذوق(الشكل 5A-C). فردي EdU +/keratin-8+ تم تقسيم الخلايا (البط البري والأصفر) وEdU +/keratin-8- النوى (الأرجواني والأرجواني)(الشكل 5B،C). كانت الخلية الزرقاء الداكنة المعروضة هي الكيراتين-8+ وكان لها شكل ممدود يتفق مع الخلايا الناضجة التي تنقل الطعم. وتظهر هذه الأسطح مع برعم الذوق الموجهة من المسام إلى قاعدة (الشكل 5B) وعلى طول المحور الطويل من برعم الذوق (الشكل 5C). ويمكن النظر إلى كل هيكل في شرائح بصرية فردية عن طريق إخفاء الفلورسينس داخل كل هيكل(الشكل 5D-F). النوى الأرجواني والأرجواني خارج حدود الكيراتين-8+ لبراعم الذوق المشار إليها بالمخطط الأبيض المنقط(الشكل 5D, E). كانت الخلايا الصفراء والبط البرية والزرقاء داخل برعم الذوق (الشكل 5D-F). يمكن إعادة بناء خلايا تحويل الذوق الفردية باستخدام برنامج التصوير القائم على البكسل إما وضع العلامات Car4 (الشكل 6A-C) أو وضع العلامات PLCβ2 (الشكل 6D-F). تم استخدام برنامج تصوير قائم على البكسل لقياس القرب الأقرب بين الخلايا وكشف أن خلية Car4 + (نفس الخلية كما هو موضح في الشكل 6B)كانت ضمن 200 نانومتر من خلية واحدة PLCβ2 + (الشكل 6G، الأخضر). المنطقة حيث كانت الخلايا داخل 200 نانومتر من بعضها البعض هو مبين في الأبيض(الشكل 6G)وأشار من قبل السهام البيضاء. وكانت الخلية الأقرب المقبل أكثر من 200 نانومتر بعيدا ويظهر باللون الأصفر في الشكل 6H، أنا في اتجاهين مختلفين. يوضح الشكل 7 عزلة وتحليل التمدين الذي ينهى داخل الحليمة (ولكن خارج برعم الذوق) ويشمل توزيعه حول برعم الذوق وبعده عن الظهارة.

Figure 1
الشكل 1: إعداد ظهارة لغوية لتلطيخ طعم برعم الفطريات. (أ) عرض اللسان المقطوع مع الظهارة والعضلات المسماة قبل أي تشريح. (ب) مرة واحدة وقد تم إزالة ما يكفي من العضلات, هناك سوى كمية صغيرة من العضلات المتبقية على الجانب السفلي من الظهارة. بالإضافة إلى تقييم التقدم المحرز في تشريح من خلال عرض الجانب قطع من الظهارة،(ج)وضع شقة الظهارة على شريحة زجاجية تحت نطاق تشريح يكشف أن بعض أجزاء من الأنسجة شفافة بالتساوي (مستطيل الأرجواني)؛ تمت إزالة ما يكفي من العضلات من هذه المنطقة. في المقابل، تشير الأسهم الأرجوانية إلى مناطق على اليسار حيث يوجد المزيد من العضلات التي تحتاج إلى إزالتها. مرة واحدة في الجانب السفلي بأكمله من ظهارة مماثلة للمنطقة في المستطيل الأرجواني، والمضي قدما إلى الخطوة التالية. (د)بعد أن تم تجميد أجزاء من الظهارة مع الجانب العضلي إلى أسفل، تتم إزالة العضلات الإضافية والبروبريا الصفيحة وأقسام رقيقة باستخدام cryostat. عند اكتمال الأقسام، تكون الظهارة المتبقية رقيقة وشفافة. (E-F) تم جمع المقاطع التسلسلية (20 ميكرومتر) على شريحة زجاجية ، وشوهد كل قسم تحت مجهر فلوري قبل قطع القسم التالي. أقل بكثير من الظهارة، وتوجه ألياف العضلات في اتجاهات متعددة بحيث ألياف العضلات موجودة على حد سواء في المقطع العرضي وعلى طول الألياف العضلية(E،مستطيل أحمر). المقاطع التسلسلية في E-F إظهار الانتقال من ألياف العضلات الموجهة في اتجاهات متعددة(E، مستطيل أحمر) إلى ألياف العضلات التي توجه في الغالب في اتجاه واحد(F، مستطيل أحمر) ، وهو ما يدل على الحدود العضلات لامينا بروبريا. منطقة أخرى من نفس قطعة من الأنسجة (المستطيلات الصفراء) يدل على أنه عندما يتم توجيه ألياف العضلات في اتجاه واحد، فإن القسم التالي من المرجح أن تسفر عن النسيج الضام لأنه تم إزالة جميع العضلات من تلك المنطقة. المستطيلات الزرقاء على حد سواء تمثل الجانب السفلي من الظهارة. إذا كانت براعم الذوق موجودة على القسم(G، السهام الحمراء) ، فقد تمت إزالة الكثير من الأنسجة. من الناحية المثالية ، يتم الانتهاء من القسمة عندما يكون الجانب السفلي من الظهارة (ولكن لا توجد براعم طعم) مرئيا في المقاطع التي تمت إزالتها(F، مستطيل أصفر). على الرغم من أن المناطق ذات الألياف العضلية الموجهة في نفس الاتجاه(E، المستطيل الأصفر و F، المستطيل الأحمر) هي أيضا مناسبة للقسم ، يجب تجنب المناطق التي تكون فيها ألياف العضلات موجهة في اتجاهات متعددة(E، مستطيل أحمر). (G) مرة واحدة وتشمل أقسام الجانب السفلي من بروبريا الظهارة / الصفيحة، فمن الممكن فقط لقطع بضعة أقسام إضافية قبل أن تتم إزالة الكثير من الظهارة وتشمل أقسام براعم الذوق. (H)يتم الكشف عن الخطأ الأكثر شيوعا من قبل أقسام cryostat حيث ينظر إلى ظهارة على حافة الأنسجة، وينظر إلى العضلات داخل الظهارة، وOTC / العضلات متناثرة موجودة في الوسط. ويرجع ذلك في معظم الأحيان إلى عدم وضع الأنسجة مسطحة على الجزء السفلي من قالب الأنسجة قبل تجميد أو تسطيح غير كافية مع ملقط حادة النهاية. أشرطة المقياس في A-C = 1 مم؛ أشرطة المقياس في E، F، H = 100 ميكرومتر؛ شريط المقياس في G = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشريح الحنك للتلطيخ. (أ) تم تشريح الحنك أولا باستخدام مقص شفرة رقيقة لقطع الحنك الصلب ،(ب)ثم باستخدام نفس المقص لفصل الحنك الرخو عن النسيج الضام الأساسي. بعد إزالة الأنسجة من تجويف الفم ، تمت إزالة أي نسيج متبقي بالمقص. عند هذه النقطة، كل ما قد تبقى هي الغدد على الجزء الخلفي من الحنك الرخو. تم استخدام شفرة حلاقة لكشط بلطف بعيدا هذه الغدد. يظهر السطح الظهاري للتشريح المكتمل للحنك (C) الظهر و (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس حجم في براعم الذوق كامل جبل. (أ) تم تصوير براعم الذوق كامل جبل من المسام الذوق إلى قاعدة برعم الذوق بحيث الطائرة من أعلى دقة هو الطائرة س ص. تم عرض كل شريحة بصرية في برنامج تحليل الصور القائم على البكسل ، وتم استخدام وظيفة الكفاف لتحديد محيط برعم الذوق الملطخ بالكيراتين-8 يدويا. (ب)يتم توفير مثال على شريحة بصرية واحدة. (ج)يظهر موقف هذا القسم التمثيلي على طول المحور الطويل لبراعم الذوق بالخط الأصفر. بعد أن تم تحديد كل مقطع بصري ، تم إنشاء سطح يمثل حجم برعم الذوق (أبيض). إخفاء أو تكرار قناة الفلورسنت المقابلة لبراعم الذوق (الكيراتين-8 في D)أو التعصيب المسمى tdTomato (الأزرق الزائف اللون في E)داخل الحجم الذي يمثل برعم الذوق. تم استخدام الفلورسينس داخل برعم الذوق في(E)لتوليد سطح يمثل حجم ال داخل برعم الذوق(F، الأزرق). (G) تم تطبيق نهج مماثل على براعم الذوق المحيطة جبل كامل في الصورة في نفس الاتجاه كما برعم طعم الفطريات في A. (H)قياس حجم براعم الذوق الفطرية والحواف وحجم كل منها من ال الداخلي كشفت أنه لا يوجد ارتباط بين برعم الذوق وحجم ال الداخلي لبراعم الذوق عينات لأي من المنطقتين. أشرطة المقياس في A-D، F = 4 ميكرومتر؛ شريط المقياس في G = 5 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من أومان غولتوآخرون. الاختصارات: FF = شكل فطري؛ السيرة الذاتية = محيط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أربور المحطة التمثيلية في براعم الذوق الفطريات باستخدام الوسم الوراثي للخلايا المتناثرة. (A)برعم طعم كامل التركيب ملطخ بعلامات الخلايا المحولة للذوق Car4 (أبيض) وPLCβ2 (أخضر). (ب) هذا برعم الذوق واثنين من المشتلات الطرفية المسمى، والتي تظهر مع برعم الذوق إزالتها بعد إعادة بناء الألياف. (ج) أربور الأزرق لديه 6 نهايات فرع وارتفاع متعامد في برعم الذوق من 33.4 ميكرومتر و (D) أربور الخضراء لديها 7 نهايات الفرع. (ه) يتم توفير dendrogram المقابلة للمشجر الأخضر مع كل طول الجزء في ميكرومتر. (F-H) تم قياس المسافة بين الهياكل. (F-G) تم تقسيم التتبع الأزرق في C ويظهر باللون الأحمر. (G)المناطق التي يكون فيها هذا المشتل الطرفي ضمن 200 نانومتر من خلية Car4 + الزرقاء الفاتحة يشار إليها بالسهام البيضاء. (F, H) يظهر أربور المحطة الطرفية الذي يمثله إعادة الإعمار الخضراء باللون الأرجواني. (H)أربور أرجواني (المرتبطة تتبع الأخضر في 4B, D) داخل 200 نانومتر من كل من الخلايا Car4 + الأزرق الداكن والضوء. شريط المقياس في A، B = 4 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس في F-H = 5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يمكن استخدام كامل يتصاعد لتتبع دمج خلايا جديدة برعم الذوق. تم حقن الفئران مع EdU لتسمية السلف التقسيم في الأيام 0 و 1 و 3 وضحى في اليوم 4. (أ, ب) يمكن تحديد الخلايا المسماة ب EdU (الأخضر) حول وداخل برعم الذوق ، والذي يحمل علامة الكيراتين -8 (A ، أبيض ، B ، رمادي). (ب, ج) الفردية EdU المسمى، الكيراتين-8+ الخلايا داخل برعم الذوق والكيراتين-8-، يتم تقسيم نواة EdU المسمى خارج برعم الذوق. (D-F) كان الفلورسينس داخل كل هيكل مجزأ في A-B ملثمين ويمكن رؤيته في المقطع العرضي. محيط برعم الذوق هو مبين مع خط أبيض منقط (D-F). (D) الخلية الصفراء داخل برعم الذوق وكلاهما EdU المسمى والكيراتين-8+. النواة أرجواني خارج برعم الذوق والكيراتين-8-. (E) الخلية البط البري داخل برعم الذوق وعلى حد سواء EdU المسمى والكيراتين-8+. النواة الأرجوانية المسماة EdU هي الكيراتين-8 - وخارج برعم الذوق (السهم الأبيض). (F)الخلية الزرقاء هي الكيراتين-8+ وممدود، بما يتفق مع الخلايا الناضجة تحويل الذوق. أشرطة المقياس في A-C = 3 ميكرومتر؛ أشرطة المقياس في D = 2 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس في E، F = 4 ميكرومتر. اختصار: EdU = 5-إيثيل-2′-deoxyuridine. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: أشكال الخلايا برعم الذوق كله يمكن تحليلها جنبا إلى جنب مع علاقاتها مع غيرها من الخلايا برعم الذوق. (A-F). تقسيم خلايا برعم الذوق الفردية لخلق السطوح يعزل خلايا برعم الذوق الفردية، وتسهيل التصور واضحة. الفردية (أ-ج) Car4 + و (D-F) PLCβ2 + الخلايا تظهر الاختلاف في أشكال الخلايا الفردية. (G)تم تحديد أقرب خلية PLCβ2+ إلى الخلية Car4 + في B لتكون ضمن 200 نانومتر (في موقع واحد صغير 0.5 ميكرومتر2 المشار إليها بواسطة السهم). وكانت الخلية الأقرب التالية أكبر من 300 نانومتر بعيدا ويمكن تمييزها كبنية منفصلة عن الخلية Car4+ مجزأة. (H, I) تم تقسيم الخلية الأقرب التالية; ويظهر الفلورسينس المقنع باللون الأصفر. النقاط الثلاث الأقرب للخلية الأقرب التالية (الأصفر) يشار إليها برؤوس الأسهم في H، I. أشرطة المقياس في A-C = 3 ميكرومتر؛ أشرطة المقياس في D, E = 4 ميكرومتر; شريط المقياس في F = 2 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس في G-I = 3 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحديد كمية ال الداخلي إلى الحليمة. (أ) بعض التسميات للخلايا العصبية الذوق أيضا تسمية ال الداخلي إلى الحليمة. (ب) 1000000 يتم فصل التمني داخل برعم الذوق من ال داخل التمييع خارج برعم الذوق عن طريق تجزئة برعم الذوق (كما هو موضح للشخصية 3)،(C)إخفاء ال الداخلي داخل برعم الذوق (الأحمر) ، ثم إخفاء ال داخل ال الداخلي خارج برعم الذوق فقط (الأزرق الداكن). وكان حجم التوريق إلى برعم الذوق (الأحمر) 1649.6 ميكرومتر3. ال الداخلي خارج برعم الذوق سوف تشمل ألياف الذوق تحت الحليمة التي لا ينبغي أن تدرج في القياس الكمي للضم إلى الحليمة. (د)تم إخفاء مضان ال الداخلي إلى الحليمة (أزرق فاتح). كان حجم ال الداخلي إلى الحليمة 121.8 ميكرومتر3. أشرطة المقياس في A-D = 4 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تطوير نهج لجمع وصمة عار باستمرار براعم الذوق كله من ثلاث مناطق طعم تجويف الفم (شكل الفطريات، circumvallate، والحنك) يوفر تحسينات كبيرة لتحليل الخلايا تحويل الذوق، وتتبع الخلايا المدمجة حديثا، التدين، والعلاقات بين هذه الهياكل. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسهل توطين علامة الخلايا العصبية الثانوية المحتملة داخل أو خارج السكان المسمى50. هذا هو ذات الصلة بشكل خاص بالنظر إلى أن الحليمة gustatory تلقي أيضا قوية التحسس سوماتوسينسوري52,53, التي قد تسمية أيضا بعض الخلايا العصبية الذوق. يمكن أيضا تصوير براعم طعم الإسكان الحليمة باستخدام تكبير أقل. وهذا يسمح تصور التعصيب إلى الحليمة بأكملها، وكذلك لبراعم الذوق، ويمكن تحليلات مستقلة من التعصيب الذي يخترق برعم الذوق والألياف العصبية المحيطة بها.

يمكن تمييز النهايات العصبية الحسية في الجلد على أساس تنظيمها حول بصيلات الشعر وعلاقاتها بالمكونات الأخرى للظهارة. التحليلات المتوازية في الحليمات gustatory قد تسفر عن توصيفات مماثلة54،55. إن إرساء أساس طبيعي للعلاقات داخل وتكوين براعم الذوق والبابيات سيكون بمثابة خط أساس لتحديد الآليات الكامنة وراء العجز في وظائف الذوق المحيطي56،57. برعم الذوق هو دينامية الحسية نهاية الجهاز حيث يتم تنسيق دوران الخلية وإعادة عرض أربور المحطة الطرفية من قبل مجموعة متنوعة من العوامل58. يمكن تعزيز التحقيقات في الدوائر المحتملة داخل برعم الذوق59، عمليات المرض57، والعلاج الكيميائي الذي يعطل وظيفة الذوق الطبيعي58 من خلال هذه الطريقة ، التي تحافظ على براعم الذوق الكامل والألياف العصبية سليمة. أسلوب التركيب الكامل الموصوف هنا يوسع إمكانيات التحليل ويصقل القياسات الممكنة.

وبالنظر إلى أن اللسان هو نسيج كثيف وغير متجانس ، وأن برعم الذوق نفسه يحتوي على العديد من تقاطعات الخلايا إلى الخلايا التي تحد من نفاذية27، فإن تطوير نهج لإنجاز تلطيخ كامل جبل براعم الذوق يمثل تحديا كبيرا. وشملت الأساليب السابقة أخذ المقاطع التمثيلية60 أو قطع أقسام أكثر سمكا ، والتي حدت بعد ذلك من اختراق الأجسام المضادة32و33و34. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اختيار براعم الذوق الكاملة من هذه الأقسام الأكثر سمكا قد تحيز البيانات نحو براعم الذوق الأصغر. بدلا من ذلك، تقشير الظهارة من المرجح أن يعطل طعم الألياف العصبية برعم. هذه ليست على وجه التحديد المسمى عند استخدام هذا النهج39،40. تشكل أربور العصب الضفيرة الكبيرة داخل برعم الذوق26،50،61، لذلك من غير الواضح ما إذا كانت إزالة الشجر تعطل العلاقات الطبيعية بين الخلايا الأخرى في برعم الذوق. وعلى النقيض من ذلك، فإن الطريقة الحالية لبراعم الذوق الكامل تسمح بقياس الأرقام والقياسات المطلقة كميا. يسمح هذا التلطيخ بالحفاظ على العديد من ميزات الخلايا المحولة (النوع والشكل والموقع) والمجاري الطرفية (بالإضافة إلى العلاقات بينها) وتحليلها.

وهناك عدة قيود على هذا النهج. على وجه الخصوص ، فإن بعض الأجسام المضادة التي تم استخدامها في الأجزاء الرقيقة62 لا تعمل في الهياكل الكاملة ، مما يحد من أنواع الهياكل التي يمكن فحصها. بالإضافة إلى ذلك ، بما أن دقة المجهر البؤري محدودة ، فإن البيانات الهيكلية التي يتم تحليلها من الخلايا الفردية ، ومن العلاقات بين الخلايا ستكون محدودة أيضا24. على سبيل المثال، يمكن تحديد الخلايا لتكون ضمن 200 نانومتر من بعضها البعض، ولكن لا يمكن فحص الهياكل المتخصصة بين الخلايا (مثل نقاط الاشتباك العصبي)63. وأخيرا، لا يمكن تسمية كافة أنواع الخلايا باستخدام هذا الأسلوب. على سبيل المثال، ثبت أنه من الصعب تسمية الخلايا التي تنقل الملح في هذا الإعداد على وجه التحديد. يمكن أن تكون هذه الخلايا مجموعة فرعية من مزيج من نوع 1، نوع الثاني، والنوع الثالث خلايا14،15،16،17،18،19،64. لا يمكن فحص خلايا النوع الأول ، التي تدعم الخلايا في المقام الأول ، في كامل يتصاعد لأنها تبدو التفاف حول خلايا أخرى ، مما يجعل من الصعب التمييز بين كيانات منفصلة65. وجود علامة موثوقة لخلايا تحويل الملح من شأنه أن يسمح لتحليلات أكثر شمولا14،66. وبالمثل، بما أن تلطيخ PLCβ2 يمثل خلايا طعم قادرة على تحويل أنواع متعددة من المحفزات، فإن التسمية التي سمحت بمزيد من الفصل بين هذا النوع من الخلايا ستكون أيضا تحسنا.

وفي ما يلي خطوات تحضيرية هامة تتطلب الرعاية. أولا، تأكد من أن طبقة العضلات التي تبقى بعد تشريح حتى ورقيقة قدر الإمكان. إذا لم تكن هذه الطبقة حتى ، فإن اختراق الأجسام المضادة لن يكون موحدا في نهاية المطاف. ثانيا، من الأهمية بمكان أن قطعة من الظهارة تكمن شقة في الجزء السفلي من قالب الأنسجة قبل التجمد، وأن تستخدم ملقط حادة النهاية للضغط بخفة على الأنسجة حتى يتم تجميده. عندما تبقى الكمية الدنيا من العضلات (في طبقة متعادلة) على الجانب السفلي من الظهارة ، فإن عددا قليلا من أقسام cryostat يصل إلى الجانب السفلي من الظهارة. تحديد المواقع من الأنسجة في cryostat، بحيث تؤخذ أقسام عبر وجه الأنسجة بأكملها، وأحيانا يؤدي إلى أجزاء من الأنسجة التي تتم إزالتها بشكل غير متساو. لهذه الأسباب، فمن المستحسن بشدة لتجنب ذوبان إضافية، مزيد من تشريح، وإعادة تجميد الأنسجة. وبدلا من ذلك، ينبغي توخي الحذر لتقييم تشريح الأنسجة قبل تجميد الأنسجة.

بشكل عام ، يمكن استخدام طريقة إعداد الأنسجة الكاملة المقدمة هنا لجمع براعم الذوق الكاملة وكذلك الحليمة المحيطة من ثلاث مناطق برعم الذوق: شكل الفطريات ، والحواف ، والحنك. على الرغم من أن مجموعة متنوعة من الأمراض الشروط56،57 والعلاج الكيميائي56 ومن المعروف أن تعطيل وظيفة الذوق ، والآليات الكامنة وراء هذه التغييرات لا تزال غير معروفة. باستخدام نهج تلطيخ كامل جبل لبراعم الذوق المعروضة هنا يمثل تصميم تجريبي قوي حيث يمكن تسمية كل من الخلايا تحويل الذوق والألياف العصبية لتحديد ما إذا كان العجز يرجع إلى فقدان نوع معين من الخلايا، والمورفولوجيا المشتل المحطة للخطر، والعلاقات المضطربة بين الخلايا تحويل الذوق، أو اضطراب العلاقات بين الخلايا العابرة والألياف العصبية الخاصة بهم. بالإضافة إلى ذلك، سيكون من الممكن ليس فقط تحديد العدد المطلق للخلايا الجديدة المسماة في براعم الذوق، ولكن أيضا تحديد عدد الخلايا الجديدة التي تحول الطعم (تسمية EdU) من نوع محدد (أي PLCβ2+ أو Car4+). ويمكن أيضا فحص ما إذا كانت هذه الخلايا الجديدة تطور الأشكال الطبيعية وتدمج عادة في برعم الذوق (أي الانتقال إلى برعم الذوق بعد العلاج). العديد من هذه التدابير، جنبا إلى جنب مع عدد برعم الذوق، يمكن أن تكون كلها مصنوعة من نفس الأنسجة، والحد من عدد الحيوانات المختلفة اللازمة للتجربة. ويمكن لهذه الاحتمالات تسهيل تبسيط الأساليب التجريبية لتوفير التدخلات السريرية للعجز في الذوق، فضلا عن توفير نظرة ثاقبة في الآليات العادية الكامنة وراء وظيفة الذوق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر كافسكا كوروبارانانتها على مساهماتها في تلطيخ الأنسجة وتصوير براعم الذوق المحيطة ، وجنيفر شو لتلطيخ وتصوير التنجين إلى الحليمة ، وKaytee Horn لرعاية الحيوانات وال جينوتيبينج ، و Liqun Ma لتلطيخ الأنسجة لبراعم الذوق الحنك الرخو. تم دعم هذا المشروع من قبل R21 DC014857 وR01 DC007176 إلى R.F.K و F31 DC017660 إلى L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

علم الأعصاب، العدد 168، برعم الذوق، جبل كامل، ال الداخلي، afferent، اللسان، الذوق
كامل جبل تلطيخ، والتصور، وتحليل الفطريات، Circumvallate، وبراعم طعم الحنك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter