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Neuroscience

Colorindo, Visualização e Análise de Papilas de Fungos, Circunvalolados e Paladar

Published: February 11, 2021
doi:
10.3791/62126
,
1Anatomical Sciences and Neurobiology,University of Louisville

Summary

Este artigo descreve métodos para preparação de tecidos, coloração e análise de papilas gustativas de fungos, circunvallato e paladar inteiros que produzem consistentemente papilas gustativas inteiras e intactas (incluindo as fibras nervosas que os inervam) e mantêm as relações entre estruturas dentro das papilas gustativas e a papila circundante.

Abstract

As papilas gustativas são coleções de células transdutoras especializadas para detectar subconjuntos de estímulos químicos na cavidade oral. Essas células transdutoras se comunicam com fibras nervosas que levam essa informação para o cérebro. Como as células transdutoras de paladar morrem continuamente e são substituídas ao longo da vida adulta, o ambiente de paladar é complexo e dinâmico, exigindo análises detalhadas de seus tipos celulares, suas localizações e quaisquer relações físicas entre elas. Análises detalhadas foram limitadas pela heterogeneidade e densidade do tecido da língua que reduziram significativamente a permeabilidade do anticorpo. Esses obstáculos requerem protocolos de secção que resultam na divisão de papilas gustativas entre as seções para que as medidas sejam apenas aproximadas, e as relações celulares sejam perdidas. Para superar esses desafios, os métodos aqui descritos envolvem a coleta, imagem e análise de papilas gustativas inteiras e arboris terminais individuais de três regiões de sabor: papilas fungiformes, papilas circunvallantes e paladar. A coleta de papilas gustativas inteiras reduz o viés e a variabilidade técnica e pode ser usada para relatar números absolutos para características como volume de paladar, invação total de paladar, contagem de células transdutoras e morfologia de arboris terminais individuais. Para demonstrar as vantagens deste método, este artigo proporciona comparações de papila gustativa e volumes de inervação entre papilas gustativas fungiformes e circunvallantes utilizando um marcador geral de paladar e um rótulo para todas as fibras de sabor. Um fluxo de trabalho para o uso de rotulagem genética de células esparsas de neurônios de sabor (com subconjuntos rotulados de células transdutoras de sabor) também é fornecido. Este fluxo de trabalho analisa as estruturas de arbores individuais de paladar-nervo, números de tipo celular e as relações físicas entre as células usando o software de análise de imagem. Juntos, esses fluxos de trabalho fornecem uma nova abordagem para a preparação e análise de tecidos de papilas gustativas inteiras e a morfologia completa de suas arboris inervas.

Introduction

As papilas gustativas são coleções de 50-100 células epiteliais especializadas que ligam subconjuntos de estímulos de gosto químico presentes na cavidade oral. Acredita-se que as células transdutoras de sabor existam como tipos1,2,3,4,5,6,7,8,9, inicialmente baseadas em critérios de microscopia eletrônica que foram posteriormente correlacionados com marcadores moleculares. As células tipo II expressam fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)2 e canal de cação potencial receptor transitório, subfamília M membro 51 e incluem células que transduem doce, amargo e umami1,10. As células tipo III expressam anidragem carbônica 4 (Car4)11 e proteína associada à sinapstosômica 258 e denotam células que respondem principalmente ao sabor azedo11. As células que transduem salgados não foram tão claramente delineadas12,13,14, mas poderiam potencialmente incluir células tipo I, Tipo II e Tipo III15,16,17,18,19. O ambiente de paladar é complexo e dinâmico, uma vez que as células transdutoras de sabor se transformam continuamente durante toda a idade adulta e são substituídas por progenitores basais3,20,21. Essas células transdutoras de sabor se conectam a fibras nervosas pseudo-unipolar do gânglio geniculado e petrosal, que passam informações de gosto para o tronco cerebral. Esses neurônios foram categorizados principalmente com base no tipo de informação de sabor que carregam22,23 porque as informações sobre sua morfologia têm sido evasivas até recentemente24. As células tipo II comunicam-se com fibras nervosas através da proteína moduladora de homeostase de cálcio 1 íon canais25, enquanto as células tipo III se comunicam através de sinapses clássicas8,26. Maior caracterização das células do paladar – incluindo linhagens do tipo celular transdutor, fatores que influenciam sua diferenciação e as estruturas de arbores de conexão são todas áreas de investigação ativa.

Estudos de paladar têm sido dificultados por vários desafios técnicos. Os tecidos heterogênios e densos que compõem a língua reduzem significativamente a permeabilidade de anticorpos para a imunohistoquímica27,28,29. Esses obstáculos têm exigido protocolos de secção que resultam na divisão de papilas gustativas entre as seções para que as medidas sejam aproximadas com base em seções representativas ou resumidas em todas as seções. Anteriormente, seções finas representativas têm sido usadas para aproximar os valores de volume e a contagem de células transdutoras30. Seção serial mais espessa permite a imagem de todas as seções de paladar e a soma das medidas de cada seção31. Cortando seções tão grossas e selecionando apenas vieses de paladar inteiros amostrando para papilas gustativas menores32,33,34. As estimativas de inervação nervosa das papilas gustativas seccionadas foram baseadas em análises dos números depixels 13,35, se quantificadas em todos os36,37,38. Essas medidas ignoram completamente a estrutura e o número de arbors nervosas individuais, porque as árvores são divididas (e geralmente mal rotuladas). Por fim, embora descascar o epitélio permita que papilas gustativas inteiras sejam manchadas39,40, ela também remove fibras nervosas gustativas e pode interromper as relações normais entre as células. Portanto, as investigações das relações estruturais dentro das papilas gustativas têm sido limitadas por causa dessa interrupção causada pelas abordagens de coloração.

A coleta de estrutura completa elimina a necessidade de seções representativas e permite a determinação de medições de valor absoluto de volumes, contagem de células e morfologias estruturais41. Essa abordagem também aumenta a precisão, limita o viés e reduz a variabilidade técnica. Este último elemento é importante porque as papilas gustativas apresentam considerável variabilidade biológica dentrode 34,42 e entre as regiões43,44, e análises de paladar inteiros permitem que números de células absolutas sejam comparados entre o controle e as condições experimentais. Além disso, a capacidade de coletar papilas gustativas intactas permite a análise das relações físicas entre diferentes células transdutoras e suas fibras nervosas associadas. Como as células transdutoras de sabor podem se comunicar entre si45 e se comunicar com as fibras nervosas46,essas relações são importantes para a função normal. Assim, as condições de perda de função podem não ser devido à perda de células, mas sim a mudanças nas relações celulares. Fornecido aqui é um método para coletar papilas gustativas inteiras para obter os benefícios de medidas absolutas para análises de volume de refino tanto para paladar quanto para suas innervações, contagem de células de paladar e formas, e para facilitar análises de relações transdutor-células e morfologias nervosas-arboriológicas. Dois fluxos de trabalho também são apresentados a jusante deste novo método de montagem total para preparação de tecidos: 1) para análise do volume da papila gustativa e inervação total e 2) para rotulagem genética de células esparsas de neurônios de paladar (com subconjuntos de células transdutoras de paladar rotuladas) e análises subsequentes da morfologia da árvore do nervo do paladar, números de tipos de células de sabor e suas formas, e o uso de software de análise de imagem para analisar as relações físicas entre células transdutoras e aquelas entre transdutores células e suas arboris nervosas. Juntos, esses fluxos de trabalho fornecem uma nova abordagem para a preparação de tecidos e para as análises de papilas gustativas inteiras e a morfologia completa de suas arboridades inervas.

Protocol

NOTA: Todos os animais foram atendidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de Serviços Públicos de Saúde dos EUA sobre o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os camundongos Phox2b-Cre (cepa MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) ou ratos TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) foram criados com ratos repórteres tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 foram criados com Phox2…

Representative Results

A coloração do epitélio lingual com anticorpos para dsRed e queratina-8 (um marcador geral de paladar) rotulou tanto as papilas gustativas inteiras quanto toda a inervação do paladar em Phox2b-Cre:tdTomato ratos50,51 (Figura 3A). A imagem dessas papilas gustativas de seus poros para suas bases deu a maior resolução x-y imagens de avião(Figura 3A, B). A função de contorno do pro…

Discussion

O desenvolvimento de uma abordagem para coletar e manchar consistentemente papilas gustativas inteiras de três regiões de sabor da cavidade oral (fungos, circunvallato e paladar) proporciona melhorias significativas para a análise de células transdutoras de paladar, rastreamento de células recém-incorporadas, inervação e relações entre essas estruturas. Além disso, facilita a localização de um potencial marcador de neurônio secundário dentro ou fora de uma população rotulada50. Is…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Kavisca Kuruparanantha por suas contribuições para a coloração de tecidos e a imagem de papilas gustativas circunvalolantes, Jennifer Xu por coloração e imagem de inervação à papila, Kaytee Horn para cuidados com animais e genotipagem, e Liqun Ma por sua coloração tecidual dos paladares macios. Este projeto foi apoiado por R21 DC014857 e R01 DC007176 para R.F.K e F31 DC017660 para L.O.

Materials

2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 
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Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).
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